Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Adaptation of avian influenza viruses of the subtype H9N2 to cells of the avian and human respiratory epithelium

Erdt, Meike

Influenza viruses initiate infection by binding of the hemagglutinin (HA) to sialic acid residues presented by cell surface components. Viruses isolated from different host species may differ in their preference for the type of sialic acid, e.g. N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac), or for a linkage type connecting the sialic acid molecule to the neighboring sugar. Influenza viruses from mammalian hosts prefer α-2,6-linked sialic acids whereas most avian influenza viruses preferentially recognize Neu5Ac attached via an α-2,3-linkage to galactose. Avian viruses of the H9 subtype are an exception, because several strains of H9 influenza viruses have been shown to favor α-2,6-linked sialic acids. This finding was surprising because in some avian species α-2,6-linked sialic acids are expressed in very low amounts, at least in the respiratory epithelium, a primary target for influenza virus infection. We analyzed the adaptation of an egg-grown avian influenza virus of the subtype H9N2 (strain A/chicken/SaudiArabia/CP7/1998) to the respiratory epithelium of chicken and turkeys. Tracheal organ cultures (TOC) served as a culture system which preserves the setting of epithelial cells as present in the avian trachea. The parental virus was passaged four times in either chicken or turkey TOCs. The progress of infection was monitored by determining the viral titer induced by this virus at various time points post infection. In the course of the passages, the virus underwent an adaptation process as indicated by an increase in the viral titer. Infection of chicken TOCs by the chicken TOC-adapted virus resulted in a 3.5-fold increase in the viral titer compared to the egg-grown virus. By contrast, infection of turkey TOCs with the turkey TOC-adapted virus was characterized by a nearly 10-fold increase in viral titer. Furthermore, Calu-3 cells, a permanent human cell line with features of the bronchiolar epithelium when grown under air-liquid interface conditions (ALI), were infected with these avian viruses. The influence of several passages in these cells was monitored and analysis of cell culture supernatants showed that avian H9N2 viruses in Calu-3 cells reached higher titers than in the TOC system. In another experiment the replication of the avian H9N2 viruses was compared to a human influenza virus (A/Puerto Rico/8/34 (PR8)) and other avian viruses. These experiments showed a clear difference between the viral titers of the different influenza viruses. The H9N2 viruses showed the highest viral titers, whereas the H7N7 virus reached the lowest titer. The human influenza virus reached a virus titer about 15-fold lower than the H9N2 viruses. In a second part of this thesis soluble hemagglutinins of different human H1N1 viruses were generated. These soluble proteins were used for binding studies on different cell lines. Moreover, in future studies they may be used as synthetic lectins to characterize the cellular binding sites for influenza viruses and their distribution on the cell surface. At first soluble forms of the H1 hemagglutinins were generated and expressed in mammalian cells. Afterwards two of the soluble H1 proteins comprising of the HA ectodomain connected to the human Fc backbone were used to perform cell-based binding assays on five different cell lines. The proteins 1918_Fc and 2009_Fc were able to bind to all cell lines analyzed. The strongest binding was observed with A549 cells.

Influenza-Viren initiieren eine Infektion von Wirtszellen durch die Bindung des Hämagglutinins (HA) an Sialinsäurereste, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Viren, die aus anderen Wirtsspezies isoliert wurden, können sich in ihrer Präferenz für eine Sialinsäure, z. B. N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac), oder durch die Art der Bindung des Sialinsäure-Moleküls an den benachbarten Zucker unterscheiden. Influenzaviren, die aus Säugetierwirten isoliert wurden, binden bevorzugt an α-2,6-verknüpfte Sialinsäuren, während die meisten aviären Influenzaviren bevorzugt Neu5Ac erkennen, die über eine α-2,3-Verknüpfung an Galactose gebunden ist. Aviäre Viren vom Subtyp H9 bilden eine Ausnahme, da für verschiedene H9-Stämme gezeigt werden konnte, dass sie bevorzugt an α-2,6-verknüpften Sialinsäuren binden. Dieses Ergebnis überraschte, da in einigen Vogelarten α-2,6-verknüpfte Sialinsäuren im respiratorischen Epithel, welches ein primäres Ziel für eine Influenzavirusinfektion darstellt, nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden. In diesem Projekt wurde die Adaptation eines im Ei hochgezogenen aviären Influenzavirus des Subtyps H9N2 (Stamm A/chicken/SaudiArabia/CP7/1998) an das respiratorische Epithel von Hühnern und Puten untersucht. Trachealringkulturen (TOC) wurden als ein Zellkultursystem verwendet, das die natürliche Anordnung der Epithelzellen der aviären Trachea aufrechterhält. Das ursprüngliche Virus wurde viermal in Hühner- bzw. Puten-TOC passagiert. Der Fortschritt der Infektion wurde durch Bestimmung des viralen Titers zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt. Im Verlauf der Passagen war das Virus einem Anpassungsprozess ausgesetzt, der durch eine Erhöhung des viralen Titers gezeigt werden konnte. Eine Infektion von Hühner-TOCs mit dem an die Hühner-TOC angepassten Virus führte zu einem 3,5-fachen Anstieg des viralen Titers im Vergleich zum ursprünglichen Virus. Im Gegensatz dazu zeigte eine Infektion von Puten-TOC mit dem an die Puten-TOC angepassten Virus einen fast 10-fachen Anstieg des viralen Titers im Vergleich zum ursprünglichen Virus. Zusätzlich wurden Calu-3-Zellen (humanes bronchial Adenokarzinom), die Merkmale des Bronchialepithels, zeigen wenn sie unter Luft-Flüssigkeits-Bedingungen (ALI) wachsen, mit diesen aviären Viren infiziert. Der Einfluss mehrerer Passagen in diesen Zellen wurde untersucht und die Analyse der Zellkulturüberstände zeigte, dass aviäre H9N2-Viren in Calu-3-Zellen höhere Titer erreichen als im TOC-System. Ein Vergleich der aviären H9N2-Viren mit einem menschlichen Influenzavirus (A/Puerto Rico/8/34 (PR8)) und weiteren aviären Viren zeigte einen deutlichen Unterschied in den viralen Titern der verschiedenen Influenzaviren. Die H9N2-Viren zeigten die höchsten Virustiter, während das H7N7-Virus den niedrigsten Titer aufwies. Das humane Influenzavirus erreichte einen etwa 15-fach niedrigeren Virustiter im Vergleich zu den H9N2-Viren. In einem zweiten Teil dieses Projekts wurden lösliche Hämagglutinine von verschiedenen menschlichen H1N1-Viren erzeugt werden. Diese wurden im weiteren Verlauf für Bindungsstudien auf verschiedenen Zelllinien verwendet. Künftig könnten sie als synthetische Lektine verwendet werden, um die zellulären Bindungsstellen für Influenzaviren und deren Verteilung auf der Zelloberfläche zu charakterisieren. Zunächst wurden lösliche Formen der H1 Hämagglutinine erzeugt und in Säugetierzellen exprimiert. Die Proteine wurden am C-Terminus mit dem Fc-Tag vom humanen Immunoglobulin G versehen. Mit zwei der erzeugten Konstrukten wurden zellbasierte Bindungstests auf fünf verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es konnte eine Bindung von 1918_Fc und 2009_Fc an alle untersuchten Zelllinien gezeigt werden. Die stärkste Bindung wurde auf A549-Zellen beobachtet.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Erdt, Meike: Adaptation of avian influenza viruses of the subtype H9N2 to cells of the avian and human respiratory epithelium. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export