Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung in Makrophagen

Frank, Constanze

Functional polarization of macrophages has an important impact on the immune response to invading pathogens as well as on the resolution of the inflammation and tissue remodeling. Macrophage plasticity is a well known phenomenon in humans and mice, yet little is known about macrophages plasticity in the bovine system. Within the scope of this research macrophage subtypes have been identified in bovine teat tissue according to their expression of S100A8/A9 (monoclonal antibody MAC387) or CD163 (monoclonal antibody AM-3K). Positive macrophages were almost mutually exclusive and showed differential distribution patterns; CD163-positive cells were preferentially located around blood vessels whereas S100A8/A9-positive cells were more abundant in subepithelial locations. The distribution pattern of these macrophage subtypes was compared between peripartum and mid-lactating cows to analyze the influence of the lactation cycle. CD163-positive macrophages revealed no differences between the groups whereas significantly more S100A8/A9-positive macrophages were detected in peripartum cows compared to mid-lactating cows. In the next step, gene expression analyses in bovine teat tissue were done by quantitative rtPCR. Due to lacking recommendations for bovine teat tissue, UXT and RPS9 were tested and successfully used as reference genes for bovine teat tissue (r = 0.81; p < 0.0001). The majority of analyzed candidate genes (S100A8, S100A9, CXCL1, CCL3 and CCL5) showed hardly any differences between mid-lactating and peripartum cows. Gene expression of S100A8 and S100A9 was higher in the Fürstenberg’s Rosette compared to the teat cistern. CD163 and CXCL8 showed higher gene expression in the teat cistern of peripartum cows (compared to mid-lactation). However, CD163 gene expression was highly variable (CV = 69.9%). Monocytes are the precursor cells for macrophages after entering tissues. The obtained results demonstrated that bovine monocytes can be distinguished from mononuclear blood cells via their selective expression of CD172a. Furthermore, bovine monocyte subpopulations could be identified as CD14-positive (71.8%) and CD14-negative or weak positive monocytes (28.4%). These subpopulations showed functional differences after stimulation with chemokines CCL2 and CCL5. CCL5-mediated activation was significantly stronger than CCL2-mediated cell activation. The rise in intracellular calcium concentration via CCL5 was significant at ≥ 10 nmol/L whereas CCL2 induced a significant increase of intracellular calcium only when used at ≥ 100 nmol/L. Furthermore, CCL5 activated the CD14-positive subpopulation significantly stronger than the CD14-negative subpopulation. Monocytes were differentiated into macrophages in the presence of CCL2 and CCL5 in order to analyze whether host factors influence the differentiation of monocytes. The impact of CCL2 and CCL5 on phenotype and gene expression profile was analysed. The presence of CCL2, CCL5 or CCL2+CCL5 (100 nmol/L each) gave rise to macrophages with significantly upregulated S100A8/A9 expression and significant downregulation of CD613 expression (compared to macrophages differentiated without chemokines). The basal gene expression of CXCL1 and CXCL8 was upregulated in CCL2 and CCL5 differentiated macrophages. Stimulation with LPS did not result in a higher gene expression in these cells. Both gene expressions of anti-inflammatory mediators (IL-10 and Arginase) and of pro-inflammatory mediators (IL-12 and iNOS) were not influenced by the presence of CCL2 and CCL5 during differentiation. Again the expression could not be significantly enhanced by stimulation with LPS in contrast to macrophages differentiated without chemokines. These findings suggest that CCL2 and CCL5 trigger a kind of endotoxin tolerance in bovine macrophages. The findings principally demonstrated the possibility of directing monocyte differentiation into different macrophage phenotypes in vitro. If a differential composition of macrophages in vivo - as demonstrated for peripartum and mid-lactation cows - is decisive for the tissue reactivity after pathogen contact, the findings within this work could be used for directing the cell composition in the udder/teat tissue in a prophylactic manner.

Die funktionelle Polarisierung von Makrophagen hat einen entscheidenden Einfluss auf die Immunantwort gegen einwandernde Keime wie auch auf die Resolution einer Entzündung und Gewebeneubildung. Makrophagen-Plastizität ist ein bekanntes Phänomen im humanen und murinen System, über die Plastizität boviner Makrophagen ist jedoch wenig bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in bovinem Zitzengewebe Makrophagensubtypen anhand der Expression von S100A8/A9 (MAC387) und CD163 (AM-3K) nachgewiesen. Die Makrophagen waren nahezu ausschließlich einfach positiv und traten an Detaillokalisationen in unterschiedlicher Häufigkeit auf: CD163-positive Zellen waren signifikant häufiger perivaskulär zu finden, während S100A8/A9-positive Zellen sich in größerer Anzahl subepithelial befanden. Um einen Einfluss des Laktationsstadiums zu untersuchen, wurde das Vorkommen von Makrophagensubtypen in mittlaktierenden und in peripartalen Tieren miteinander verglichen. Für CD163-positive Makrophagen waren keine Unterschiede in Anzahl und Verteilungsmuster positiver Zellen feststellbar, während signifikant mehr S100A8/A9-positive Zellen in der peripartalen Gruppe im Vergleich zu mittlaktierenden Tieren detektiert werden konnten. In einem zweiten Teil wurden Genexpressionsanalysen in bovinem Zitzengewebe mittels quantitativer rtPCR durchgeführt. Aufgrund fehlender Empfehlungen für bovines Zitzengewebe wurden UXT und RPS9 erstmals als Referenzgene für bovines Zitzengewebe geprüft und erfolgreich eingesetzt (r = 0,81; p < 0,0001). Die Mehrzahl der analysierten Kandidatengene (S100A8, S100A9, CXCL1, CCL3 und CCL5) zeigten nahezu keine Unterschiede in der Expression zwischen der mittlaktierenden Gruppe und der peripartalen Gruppe. Die Genexpression von S100A8 und S100A9 war in der Fürstenberg’schen Rosette höher als in der Zitzenzisterne. Für CD163 und CXCL8 wurde eine höhere Genexpression in der Zitzenzisterne der peripartalen Gruppe erfasst (verglichen mit der Fürstenberg’schen Rosette der peripartalen Gruppe und verglichen mit der Zitzenzisterne der mittlaktierenden Gruppe). Die Expression von CD163 war jedoch von einer starken Varianz geprägt (CV = 69,9%). Monozyten sind die Vorläuferzellen, aus denen sich Makrophagen nach Einwanderung ins Gewebe differenzieren. In einem weiteren Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass bovine Monozyten in einem Gemisch aus mononukleären Zellen des Blutes anhand ihrer exklusiven Expression von CD172a identifiziert werden können. Innerhalb der Monozyten wurden durch die differenzielle Expression von CD14 eine größere CD14-positive (71,8%) und eine kleinere CD14-negative oder schwach positive Monozyten-Subpopulation (28,4%) erfasst. Funktionelle Unterschiede der Monozyten-Subpopulationen ergaben sich nach Stimulation mit den Chemokinen CCL2 und CCL5. Die CCL5-vermittelte Zellaktivierung war signifikant stärker als die CCL2-vermittelte. So führte CCL5 ab einer Konzentration von 10 nmol/L zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration, CCL2 hingegen erst ab 100 nmol/L. Darüber hinaus wurden CD14-positive Monozyten durch CCL5 signifikant stärker aktiviert als CD14-negative Monozyten. Um zu untersuchen, ob Wirtsfaktoren die gerichtete Differenzierung von Monozyten beeinflussen, wurden Monozyten in Anwesenheit von CCL2 und CCL5 zu Makrophagen differenziert. Der Einfluss von CCL2 und CCL5 auf die In-vitro-Differenzierung boviner Monozyten wurde hierbei phänotypisch und anhand von Genexpressionsmessungen untersucht. Die Differenzierung boviner Monozyten in Anwesenheit von CCL2, CCL5 oder CCL2+5 (je 100nmol/L) führte zu einer signifikanten Zunahme der S100A8/A9-Expression und zu einer signifikant verminderten CD163-Expression im Vergleich zu Makrophagen, die ohne Chemokinzusatz differenzierten. Die Basis-Genexpression von CXCL1 und CXCL8 wurde durch die Differenzierung unter CCL2 oder CCL5 hochreguliert. Diese ließ sich durch eine Aktivierung der Zellen mit LPS nicht erhöhen. Sowohl anti-inflammatorische Mediatoren (IL-10 und Arginase) als auch pro-inflammatorische Mediatoren (IL-12 und iNOS) zeigten hingegen keine veränderte Basisexpression in CCL2- oder CCL5-differenzierten Makrophagen im Vergleich zu Makrophagen, die ohne Chemokinzusatz differenzierten. Auch deren Expression ließ sich durch LPS-Stimulation im Gegensatz zu Medium-differenzierten Makrophagen nicht signifikant erhöhen. Dies deutet darauf hin, dass CCL2 und CCL5 eine Form der Endotoxin-Toleranz von Makrophagen induzieren können. In der vorliegenden Arbeit konnte prinzipiell gezeigt werden, dass sich die Differenzierung von Monozyten in unterschiedliche Makrohagenphänotypen in vitro steuern lässt. Wenn die unterschiedliche Zusammensetzung der Makrophagenpopulationen in vivo - wie sie für den Vergleich Peripartum/Mittlaktation gezeigt wurde - für die Gesamtreaktivität des Gewebes nach Erregerkontakt entscheidend ist, dann können diese Ergebnisse mittelfristig dafür verwendet werden, prophylaktisch die Gewebebesiedelung lokal im Euter/in der Zitze zu steuern.

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Frank, Constanze: Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung in Makrophagen. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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