Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Fourier transform infrared spectroscopy studies on freezing-induced membrane phase behavior of stallion sperm in the presence of cryoprotective agents

Gojowsky, Marina

Cryopreserved stallion sperm displays a high degree of variation in survival after freezing and thawing. Insight in the mode of action of cryoprotectants may help improve cryopreservation protocols. The aim of the current studies was to determine the effect of various cryoprotective agents on cryosurvival as well as membrane phase behavior of stallion sperm during freezing. Freezing-induced membrane changes were studied to obtain insights in subzero water transport parameters. The used cryoprotectants differ in their membrane permeating properties and osmotic activity and included increasing concentrations of glycerol, ethylene glycol, sucrose or HES (hydroxyethyl starch). Motility and viability were determined upon addition of increasing concentrations of cryoprotective agents as well as upon return to isotonic conditions, in order to evaluate survival upon osmotic stress for these conditions. To evaluate the protective properties of the cryoprotectants for cryopreservation, survival was determined prior and after freezing and thawing. Viability was considered as (im)permeability of sperm to PI/SYBR14 fluorescence dies and was determined directly in freezing extender, using CASA equipped with fluorescence microscopy, as well as after dilution in isotonic buffer, using flow cytometry. Similar percentages of post-thaw motile and membrane intact sperm were obtained when using 343 mM glycerol, 550 mM ethylene glycol, 75 mM sucrose or 7.5-10 % HES. For glycerol, ethylene glycol and sucrose an optimum concentration for cryopreservation was found, due to increasing toxicity and osmotic stress when used at high concentrations. In contrast, use of increasing concentrations of the osmotic inactive HES resulted in increased cryosurvival. In order to determine effects of cryoprotectants on the freezing-induced membrane phase transition, Fourier transform infrared spectroscopy was used. In addition, subzero membrane hydraulic permeability parameters were derived from these data, which express water transport across cellular membranes during freezing and can be used to predict freezing-induced cellular dehydration in response to the cooling rate. None of the cryoprotectants tested did prevent freezing-induced membrane phase changes. Freezing-induced membrane dehydration in the presence of cryoprotectants, however, occurred more gradually and over a wider temperature range. This is reflected in the lower ELp values in the presence of cryoprotectants as compared to absence of cryoprotectants. Water transport parameters did not exhibit large differences for sperm frozen in the presence of the osmotic active cryoprotectants with different membrane permeability coefficients which were tested. Higher concentration had a more severe effect. For similar percentages of non-permeating sucrose and HES it was found that the extent of membrane dehydration was larger for sucrose as for the osmotic inactive HES. Maximum freezing-induced membrane dehydration for stallion sperm frozen in INRA82 supplemented with HES was similar as for INRA82 alone. Taken together, glycerol, ethylene glycol, sucrose or HES can be used for cryopreservation of stallion sperm. Similar percentages of post-thaw motile and viable sperm directly in freezing extender as well as after return to isotonic conditions can be obtained, when taken into account: osmotic stress during cryoprotectant addition and upon dilution into isotonic solution, as well as toxicity and cryoprotective properties of the cryoprotectant, and cryoprotectant effect on membrane phase behavior. We postulate that cryoprotectants do not prevent freezing-induced membrane dehydration but their role seems to slow down the dehydration rate.

Immer noch ist es nicht möglich, von allen Hengsten Tiefgefriersamen konstanter Qualität zu produzieren. Um dies zu erreichen, ist weitere Forschung an Kryoprotektiva und ihrer Wirkungsweise an der Zellmembran nötig. Die durchgeführten Studien hatten das Ziel, den Einfluss verschiedener Kryoprotektiva auf die Spermaqualität vor und nach dem Einfrieren und den Einfluss auf die biophysikalischen Zellmembranparameter (ELp und Lpg) der Hengstspermien zu bestimmen. Die Membranphasen-Messungen während des Gefriervorganges dienten der Gewinnung von Erkenntnissen über den zellulären Wassertransport bei Minustemperaturen unter verschiedenen Bedingungen. Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose und HES (Hydroxyethylstärke) unterscheiden sich sowohl in ihrer Membranpermeabilität als auch in ihrer osmotischen Aktivität voneinander und wurden jeweils in einer Konzentrationsreihe getestet. Um den durch die Kryoprotektiva induzierten osmotischen Stress und dessen Einfluss auf Motilität und Viabilität zu bestimmen, wurden diese Parameter sowohl an den Spermien in dem jeweiligen Verdünner als auch nach Verdünnung in isotonischem HBS gemessen. Motilität und Viabilität wurden vor und nach dem Einfrieren gemessen um das kryoprotektive Potential von Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose und HES zu beurteilen. Als „vital“ wurden diejenigen Spermien betrachtet, deren Membran von dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR14, nicht jedoch von Propidium Iodid überwunden werden konnte. Die Fluoreszenzfärbung der Spermien im jeweiligen Verdünner wurde durch ein Fluoreszenzmikroskop gekoppeltes CASA-System detektiert, während die Messung nach Verdünnung der Spermien in isotonischem HBS mittels Flowzytometer erfolgte. Die Verwendung von 343 mM Glycerol, 550 mM Ethylenglycol, 75 mM Sucrose oder 7.5-10 % HES führte nach dem Auftauen zu ähnlichen Werten in der Motilität und Viabilität. Die protektive Wirkung von Glycerol, Ethylenglycol und Sucrose wird mit steigender Konzentration durch die zunehmende Toxizität und osmotisch induzierte Schädigung aufgehoben, weshalb jeweils ein Optimum für die Konzentration bestimmt werden konnte. Im Gegensatz dazu führt die Erhöhung der Konzentration von HES zu einer kontinuierlichen Verbesserung der Motilität und Viabilität nach dem Auftauen. Der Einfluss der Kryoprotektiva auf die kälteinduzierte Membranphasenübergänge wurde durch FTIR-Spektroskopie während des Einfrierens ermittelt. Davon abgeleitet wurde die hydraulische Leitfähigkeit der Membran, die verwendet werden kann, um die einfrierinduzierte Dehydratation in Abhängigkeit von der Einfriergeschwindigkeit zu bestimmen. Dabei wurde festgestellt, dass keine der als Kryoprotektivum verwendete Substanz die Membranphasenveränderungen während des Einfrierens verhindert, aber deren Anwesenheit dazu führt, dass die Austrocknung der Zellmembran gradueller und insgesamt über einen größeren Temperaturbereich erfolgt. Dies wird auch durch die niedrigeren ELp-Werte in Medien mit Kryoprotektiva deutlich. Bezüglich der hydraulischen Leitfähigkeit der Membran wurden keine großen Unterschiede zwischen den einzelnen osmotisch aktiven Kryoprotektiva mit unterschiedlicher Membranpermeabilität festgestellt. Die Verwendung höherer Konzentrationen führte bei allen osmotisch aktiven Kryoprotektiva zu einem stärkeren Effekt. Werden die Membran-impermeablen Kryoprotektiva Sucrose und HES in ähnlicher Konzentration zugesetzt, so wird die Membran in Anwesenheit der osmotisch aktiven Sucrose stärker ausgetrocknet als bei der Verwendung des osmotisch inaktiven HES. Die stärkste durch den Gefriervorgang induzierbare Membranaustrocknung, erzielt durch Nukleation nahe 0 °C, erreichte bei Hengstspermien in HES-haltigem INRA82 ein ähnliches Ausmaß wie für Spermien in reinem INRA82. Insgesamt lässt sich sagen, dass sich prinzipiell sowohl Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose als auch HES für die TG-Spermaherstellung eignen. Wenn der osmotische Stress, verursacht durch die Zugabe des Kryoprotektivums und die Überführung in isotonisches Milieu, die Toxizität und die schützende Wirkung des Kryoprotektivums und dessen Einfluss auf das Membranphasenverhalten berücksichtigt werden, lassen sich nach dem Auftauen ähnliche Motilitäts- und Viabilitätswerte sowohl vor als auch nach Überführung aus dem Verdünner in eine isotonische Lösung, erreichen. Wir folgern aus den Ergebnissen der FTIR-Studie, dass Kryoprotektiva die Membranaustrocknung nicht verhindern, aber deren Geschwindigkeit mäßigen.

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Gojowsky, Marina: Fourier transform infrared spectroscopy studies on freezing-induced membrane phase behavior of stallion sperm in the presence of cryoprotective agents. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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