Fourier transform infrared spectroscopy studies on freezing-induced membrane phase behavior of stallion sperm in the presence of cryoprotective agents

Immer noch ist es nicht möglich, von allen Hengsten Tiefgefriersamen konstanter Qualität zu produzieren. Um dies zu erreichen, ist weitere Forschung an Kryoprotektiva und ihrer Wirkungsweise an der Zellmembran nötig. Die durchgeführten Studien hatten das Ziel, den Einfluss verschiedener Kryoprotektiva auf die Spermaqualität vor und nach dem Einfrieren und den Einfluss auf die biophysikalischen Zellmembranparameter (ELp und Lpg) der Hengstspermien zu bestimmen. Die Membranphasen-Messungen während des Gefriervorganges dienten der Gewinnung von Erkenntnissen über den zellulären Wassertransport bei Minustemperaturen unter verschiedenen Bedingungen. Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose und HES (Hydroxyethylstärke) unterscheiden sich sowohl in ihrer Membranpermeabilität als auch in ihrer osmotischen Aktivität voneinander und wurden jeweils in einer Konzentrationsreihe getestet. Um den durch die Kryoprotektiva induzierten osmotischen Stress und dessen Einfluss auf Motilität und Viabilität zu bestimmen, wurden diese Parameter sowohl an den Spermien in dem jeweiligen Verdünner als auch nach Verdünnung in isotonischem HBS gemessen. Motilität und Viabilität wurden vor und nach dem Einfrieren gemessen um das kryoprotektive Potential von Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose und HES zu beurteilen. Als „vital“ wurden diejenigen Spermien betrachtet, deren Membran von dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR14, nicht jedoch von Propidium Iodid überwunden werden konnte. Die Fluoreszenzfärbung der Spermien im jeweiligen Verdünner wurde durch ein Fluoreszenzmikroskop gekoppeltes CASA-System detektiert, während die Messung nach Verdünnung der Spermien in isotonischem HBS mittels Flowzytometer erfolgte. Die Verwendung von 343 mM Glycerol, 550 mM Ethylenglycol, 75 mM Sucrose oder 7.5-10 % HES führte nach dem Auftauen zu ähnlichen Werten in der Motilität und Viabilität. Die protektive Wirkung von Glycerol, Ethylenglycol und Sucrose wird mit steigender Konzentration durch die zunehmende Toxizität und osmotisch induzierte Schädigung aufgehoben, weshalb jeweils ein Optimum für die Konzentration bestimmt werden konnte. Im Gegensatz dazu führt die Erhöhung der Konzentration von HES zu einer kontinuierlichen Verbesserung der Motilität und Viabilität nach dem Auftauen. Der Einfluss der Kryoprotektiva auf die kälteinduzierte Membranphasenübergänge wurde durch FTIR-Spektroskopie während des Einfrierens ermittelt. Davon abgeleitet wurde die hydraulische Leitfähigkeit der Membran, die verwendet werden kann, um die einfrierinduzierte Dehydratation in Abhängigkeit von der Einfriergeschwindigkeit zu bestimmen. Dabei wurde festgestellt, dass keine der als Kryoprotektivum verwendete Substanz die Membranphasenveränderungen während des Einfrierens verhindert, aber deren Anwesenheit dazu führt, dass die Austrocknung der Zellmembran gradueller und insgesamt über einen größeren Temperaturbereich erfolgt. Dies wird auch durch die niedrigeren ELp-Werte in Medien mit Kryoprotektiva deutlich. Bezüglich der hydraulischen Leitfähigkeit der Membran wurden keine großen Unterschiede zwischen den einzelnen osmotisch aktiven Kryoprotektiva mit unterschiedlicher Membranpermeabilität festgestellt. Die Verwendung höherer Konzentrationen führte bei allen osmotisch aktiven Kryoprotektiva zu einem stärkeren Effekt. Werden die Membran-impermeablen Kryoprotektiva Sucrose und HES in ähnlicher Konzentration zugesetzt, so wird die Membran in Anwesenheit der osmotisch aktiven Sucrose stärker ausgetrocknet als bei der Verwendung des osmotisch inaktiven HES. Die stärkste durch den Gefriervorgang induzierbare Membranaustrocknung, erzielt durch Nukleation nahe 0 °C, erreichte bei Hengstspermien in HES-haltigem INRA82 ein ähnliches Ausmaß wie für Spermien in reinem INRA82. Insgesamt lässt sich sagen, dass sich prinzipiell sowohl Glycerol, Ethylenglycol, Sucrose als auch HES für die TG-Spermaherstellung eignen. Wenn der osmotische Stress, verursacht durch die Zugabe des Kryoprotektivums und die Überführung in isotonisches Milieu, die Toxizität und die schützende Wirkung des Kryoprotektivums und dessen Einfluss auf das Membranphasenverhalten berücksichtigt werden, lassen sich nach dem Auftauen ähnliche Motilitäts- und Viabilitätswerte sowohl vor als auch nach Überführung aus dem Verdünner in eine isotonische Lösung, erreichen. Wir folgern aus den Ergebnissen der FTIR-Studie, dass Kryoprotektiva die Membranaustrocknung nicht verhindern, aber deren Geschwindigkeit mäßigen.