Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Toxicological and immunological effects of DON and LPS at the intestinal barrier

Halawa, Amal Abd El-Moniem Ali

The objectives of this study were to examine the effect of DON either in feed or in vitro as well as intraperitoneal LPS on the short circuit currents and tissue conductances across the small intestines of growing pigs in vitro, evaluation of DON transport in vitro across jejunal mucosa of growing pigs and estimation of the immunological effect of DON as well as LPS to induce cytokine secretion. The study was done in two series, in the first series the effect of different in vitro DON concentrations on Isc and Gt was investigated in six animals across duodenum, mid jejunum and ileum using Ussing technique. In the second series segments from mid jejunum were collected from 16 animals. The animals were divided into two groups, control and DON-fed groups. In DON-fed group, the animals were kept on diet containing 2.901 mg DON/kg feed for about 5 weeks. From each group four animals were injected intraperitoneally with 5 µg LPS/kg BW 3h before slaughtering. Blood samples were collected from all animals directly after slaughtering for plasma DON and cytokine analysis. Buffer samples were collected at 30 and 90 min after addition of DON from both, mucosal and serosal sides of Ussing chambers for measuring of DON concentrations using LC-ESI-MS/MS technique. Under basal conditions, duodenum and jejunum showed higher Isc compared with ileum which expressed higher Isc values under nutrient stimulated conditions. Among the examined concentrations, in vitro DON at 4000 and 8000 ng/ml reduced the electrogenic transport of both alanine and glucose across jejunal mucosa of growing pigs. Feeding DON at 2.901 mg/kg feed did not affect significantly the Isc or Gt across porcine intestinal segments. In LPS groups the Isc values were higher compared with non-injected groups, but without significant effect of LPS. Plasma analysis revealed higher TNF-α concentrations in LPS-injected groups compared with control and DON groups. As expected, higher plasma DON concentrations were found in DON-fed groups compared with controls. In DON transport study, lower mucosal amount of DON was observed at 4000 ng/ml compared to that at 8000 ng/ml in all groups. The mucosal uptake of DON in DON-fed groups was significantly higher than that in control groups. Intraperitoneal LPS did not affect on DON transport. Results of the first series showed that the response of porcine small intestines to the electrogenic nutrient transport varied with the type of the intestinal segments particularly ileum. In the second series, DON inhibited the electrogenic transport of alanine and glucose across jejunal mucosa of growing pigs. Both DON and LPS could induce secretion of the proinflammatory cytokines especially TNF-α. Systemic LPS tend to increase the Isc propably via the action of TNF-α, the point which is recommended to be evaluated in pigs. DON transport was proportional to its initial concentrations, with a respective effect of DON in feed on DON transport.

Ziel dieser Studie war es, die Effekte von in vivo verabreichten DON-haltigen Futtermitteln, direkt in vitro appliziertem DON und in vivo intraperitoneal verabreichtem LPS auf die Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten im Dünndarm wachsender Schweine zu untersuchen. Darüber hinaus wurden in vitro Messungen zum Transport von DON über das Darmepithel durchgeführt und eine Einschätzung der immunologischen Wirkung von DON und LPS vorgenommen, in dem die Stimulation der Zytokinsekretion in vivo quantifiziert wurde. Die Studie wurde in zwei Serien durchgeführt. In der ersten Serie wurden Abschnitte aus dem Duodenum, dem mittleren Jejunum und dem Ileum von sechs Schweinen verwendet, um die in vitro Effekte von DON in verschiedenen Konzentrationen auf die Kurzschlussströme und die Gewebeleitfähigkeiten des Darmepithels in An- und Abwesenheit von Alanin und Glucose mithilfe der Ussing-Kammer-Technik zu untersuchen. In der zweiten, mit 16 Schweinen durchgeführten Serie wurden ausschließlich Segmente aus dem mittleren Jejunum verwendet. Die Tiere wurden in zwei Fütterungsgruppen aufgeteilt. Die DON-Gruppe erhielt über einen Zeitraum von zwei Wochen eine Ration mit 2,901 mg DON / kg, während die anderen Tiere mit Kontrollfutter versorgt wurden. Drei Stunden vor dem Schlachten wurden je vier Tiere der beiden Fütterungsgruppen mit 5 µg LPS / kg intraperitoneal behandelt. Unmittelbar nach dem Töten wurden Plasmaproben zur Bestimmung von DON- und Zytokinkonzentrationen sowie das Jejunum für die Using-Kammer-Experimente entnommen. Um den Transport von DON über das Epithel zu quantifizieren, wurden die DON-Konzentrationen in den serosalen und mucosalen Kompartimenten der Ussing-Kammer nach 30 und 90 min Inkubationszeit mithilfe der LC-MS/MS Technik analysiert. Unter basalen Bedingungen zeigten das Duodenum und das Jejunums höhere Kurzschlussströme als das Ileum. Nach Zugabe der Nährstoffe Alanin und Glucose konnten die höchsten Werte im Ileum beobachtet werden. Eine in vitro Applikation von 4000 bzw. 8000 ng DON / ml reduzierte die Alanin- und Glucose-induzierten Kurschlussströme im Jejunum signifikant, während die Fütterung des DON- kontaminierten Futters keinen signifikanten Einfluss auf die elektrophysiologischen Parameter hatte. Die Behandlung mit LPS führte zu einer Erhöhung der TNF-α-Konzentrationen im Plasma. Die Nährstoff-induzierten Kurzschlussströme behandelter Tiere waren im Vergleich zu unbehandelten Schweinen jedoch nur tendenziell höher. Generell korrelierte der Transport von DON über das Epithel mit der mucosalen Konzentration von DON, wobei die mukosale Aufnahme von DON bei zuvor zwei Wochen lang mit DON-kontaminiertem Futter versorgten Tieren signifikant höher als in den Kontrollgruppen war. Die intraperitoneale Behandlung mit LPS hatte keine Wirkung auf den in-vitro gemessenen DON-Transport. Die Ergebnisse der ersten Serie haben gezeigt, dass der elektrogene Nährstofftransport entlang der Achse des porcinen Dünndarms variiert. In der zweiten Serie konnte beobachtet werden, dass DON der elektrogenen Transport von Alanin und Glucose im Jejunum hemmt. Sowohl DON als auch LPS induzieren die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF-α, was indirekt zu der nach Behandlung mit LPS beobachteten tendenziellen Erhöhung des Kurzschlussstroms geführt haben könnte. Nähere Untersuchungen diesbezüglich und zum Transportmechanismus von DON, der offensichtlich durch eine längere Exposition stimuliert wird, sollten in zukünftigen Studien durchgeführt werden.

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Halawa, Amal Abd El-Moniem Ali: Toxicological and immunological effects of DON and LPS at the intestinal barrier. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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