The pathogenic role of matrix metalloproteinases in a virus-induced mouse model of demyelinating diseases

Hansmann, Florian Heinrich

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The pathogenic role of matrix metalloproteinases in a virus-induced mouse model of demyelinating diseases

German
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Matrix Metalloproteinasen (MMPs) stellen eine Familie von Zink-abhängigen Proteasen dar, die an der Pathogenese von demyelinisierenden Erkrankungen wie Staupevirus-Enzephalitis, muriner Theilervirus-Enzephalomyelitis oder Multipler Sklerose beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden die folgenden Experimente durchgeführt: 1.) Microarray-Analyse von unterschiedlich exprimierten Genen im Rückenmark von Theilervirus-infizierten im Vergleich zu Mock-infizierten SJL/J Mäusen. 2.) In vitro-Untersuchung der MMP-Transkription in infizierten und nicht-infizierten Astrozyten und Mikrogliazellen von SJL/J Mäusen. 3.) Stereotaktische Injektion von 440 ng in vitro aktiviertem, rekombinantem, murinem MMP-3, -9 und -12 in den kaudalen Kleinhirnstiel von adulten SJL/JOlaHsd Mäusen (3-4 weibliche Mäuse pro Gruppe; Untersuchungszeitpunkte: 12, 24, 72 und 168 Stunden nach stereotaktischer Injektion) zur Untersuchung der Auswirkungen von MMP-3, -9 und -12 auf Entmarkung, Blut-Hirnschranken-Schaden sowie Infiltration von Entzündungszellen. 4.) Intrazerebrale Theilervirus-Infektion von Mmp3 und Mmp12 Knockout Mäusen (über 10 Generation auf SJL/JOlaHsd genetischen Hintergrund rückgekreuzt; 6-7 weibliche Mäuse pro Gruppe; Untersuchungszeitpunkte: 0, 1, 28 und 98 Tage nach Infektion). Als Kontrolltiere wurden Medium-injizierte knockout Mäuse sowie Medium-injizierte Wildtyp-Mäuse (SJL/JOlaHsd) verwendet. 5.) Erstbeschreibung einer spinalen Epidermoidzyste bei einer SJL/JOlaHsd Maus ohne klinische Symptome. Die Mikroarray-Analyse der transkriptionellen Veränderungen während der Theilervirus-Enzephalomyelitis in vivo zeigte eine deutliche und progressive Aufregulierung von Mmp12. Darüber hinaus waren an verschiedenen Zeitpunkten Mmp2, -3, -13, -14, -16, -19, Timp1 und -2 hochreguliert, während Mmp9, -17, -24, -28 und Timp4 herunterreguliert waren. Die in vitro-Untersuchung von Astrozyten und Mikrogliazellen ergab, dass diese Zellen eine konstitutive Expression von Mmp2, -3, -9, -10, -12, -13, -14, -15, -24 und Timp2-4 zeigen. In Astrozyten fand sich nach der Theilervirus-Infektion eine starke Aufregulierung von Mmp3-, -9-, -10-, -12-, -13- und Timp1-Transkripten. Um zu klären, ob diese MMPs im Wesentlichen zur Entmarkung in vivo beitragen, wurden stereotaktisch in vitro aktivierte, rekombinante, murine MMP-3, -9 und -12 in den kaudalen Kleinhirnstiel von adulten SJL/JOlaHsd Mäusen injiziert. Die Applikation induzierte eine Entmarkung und einen Verlust von Oligodendrozyten bevor eine Infiltration von Entzündungszellen festzustellen war. Dies spricht für eine Myelin- und/oder Oligodendrozyten-toxische Wirkung aller drei untersuchten MMPs. Darüber hinaus wurde mittels Quantifizierung von Evansblue und Immunglobulin G-Extravasation ein Blut-Hirnschranken-Schaden festgestellt, der auf eine Beteiligung der MMPs bei der Auswanderung von Entzündungszellen hindeutet. Um herauszufinden, ob MMP-3 und/oder MMP-12 wichtige Schlüsselmoleküle in der Pathogenese der Entmarkung darstellen, wurden Mmp3 und Mmp12 knockout Mäuse mit dem BeAn Stamm des Theilervirus infiziert. Mmp12 knockout Mäuse zeigten eine verminderte Entmarkung und Makrophageninfiltration sowie geringere motorische Defizite im Verlauf der Theilervirus-Enzephalomyelitis im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Mmp3 knockout-Mäuse wiesen keine Unterschiede im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen auf. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass MMP-12 eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese von demyelinisierenden Erkrankungen spielt. Die Hemmung von MMP-12 könnte einen geeigneten, therapeutischen Ansatz darstellen um eine chronisch-progressive Demyelinisierung zu verhindern oder den Krankheitsverlauf günstig zu beeinflussen.

Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of zinc-dependent proteases which are involved in the pathogenesis of demyelinating diseases like canine distemper, Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) or Multiple Sclerosis. In this work the following experiments have been carried out: 1.) Microarray analysis of differentially expressed genes in the spinal cord of TMEV-infected compared with mock-infected SJL/J mice. 2.) In vitro investigation of MMP-transcription in normal and TMEV-infected astrocytes and microglia from SJL/J mice. 3.) Stereotaxic injection of 440 ng in vitro activated, recombinant murine MMP-3, -9 and -12 into the caudal cerebellar peduncle (CCP) of adult SJL/JOlaHsd mice (3-4 female mice per group; necropsy at 12, 24, 72 and 168 hours post MMP-injection) to investigate the impact of MMP-3, -9 and -12 on demyelination, blood brain barrier leakage, and infiltration of inflammatory cells. 4.) Intracerebral TMEV infection of Mmp3 and Mmp12 knock-out mice (in-house backcrossed over 10 generations on a SJL/JOlaHsd genetic background; 6-7 female mice per group, necropsy at 0, 1, 28 and 98 days post infection). Controls included mock-infected (medium only) knock-out animals as well as TMEV- and mock-infected SJL/JOlaHsd (wild type) mice. 5.) First description of a spinal epidermoid cyst in a SJL/JOlaHsd mouse without associated clinical signs. Microarray analysis of transcriptional changes during TME in vivo revealed a marked and progressive upregulation of Mmp12. In addition, Mmp2, -3, -13, -14, -16 -19 and Timp1, -2 were upregulated, while Mmp9, -17, -24, -28 and Timp4 were downregulated at various time points. Furthermore, investigations of astrocytes and microglia cells in vitro revealed a constitutive expression of Mmp2, -3, -9, -10, -12, -13, -14, -15, -24 and Timp2 to -4. TMEV-infection of astrocytes in vitro induced a prominent upregulation of Mmp3, -9, -10, -12, and -13 as well as Timp1 transcripts. To clarify whether these MMPs contribute essentially to demyelination in vivo, stereotaxic injection of in vitro activated, recombinant murine MMP-3, -9 and -12 into the CCP of adult SJL/J was performed. This induced demyelination and loss of oligodendrocytes prior to the infiltration of inflammatory cells indicating a myelin- and/or oligodendrocyte-toxic mode of action of all three MMPs. Furthermore, following MMP-injection a BBB-leakage was observed, indicating a role of MMPs in the extravasation of inflammatory cells. To elucidate whether Mmp3 and/or Mmp12 are essential key molecules in the process of demyelination Mmp3 and Mmp12 knockout mice were intracerebrally infected with the BeAn strain of TMEV. Mmp12 knockout mice showed reduced demyelination, macrophage infiltration and motor deficits during TME compared with wild-type mice, whereas Mmp3 knockout mice did not. In conclusion, MMP-12 plays an essential role in the pathogenesis of demyelinating diseases and the interruption of its cascade may be a suitable therapeutic approach to prevent chronic progressive demyelination or to ameliorate the disease process.