Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The impact of cuprizone on the murine spinal cord and the progrssion of Theiler's murine encephalomyelitis

Herder, Vanessa

Multiple sclerosis is one of the most common central nervous system diseases in young adults. The primary cause of multiple sclerosis is unknown. However, different virus infections are currently discussed to initiate autoimmunity causing inflammation and myelin loss in the brain and spinal cord. Thus, therapeutic strategies focus upon the reduction of inflammatory responses and tissue damage in affected patients. Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) is a widely used virus-induced murine model for multiple sclerosis and enables the investigation of therapeutic strategies in this human disease. However, immunosuppressive approaches generally reduce antiviral immunity, hence increasing virus dissemination with clinical worsening in this animal model of myelin disorders. Therefore, the aim of the present study was to determine whether cuprizone exerts beneficial effects by inhibiting immune-mediated tissue damage, as observed in EAE, or detrimental effects by reducing antiviral immunity possibly leading to disease exacerbation. Since TMEV induces demyelination predominately in the spinal cord and information about region-specific effects of cuprizone in this CNS compartment are sparse, the impact of cuprizone upon the murine spinal cord was evaluated in the first part of the study. Based upon the hypothesis that glial cell distribution and toxin-related susceptibility differs between CNS regions, the aim of this part was to investigate and compare the impact of cuprizone on myelin integrity in the spinal in SJL- and C57BL/6-mice and in the corpus callosum. Though cuprizone-feeding resulted in expected characteristic lesions in the corpus callosum of SJL-mice after a five weeks feeding period, no myelin damage, as determined by luxol fast blue staining as well as myelin basic protein (MBP)-, proteolipid protein (PLP)- and CNPase-specific immunohistochemistry, was found in the spinal cord white and grey matter in both mouse strains. In addition, the number of astrocytes as well as T and B cells did not differ between cuprizone-fed and control animals in the spinal cord. However, microglial activation was observed after withdrawal of the toxin as demonstrated by CD107b-immunohistochemistry and CD11b-specific RT-qPCR in SJL-mice. C57BL/6-mice showed no differences in myelin gene expression at all investigated time points. In the early phase of cuprizone-feeding, apoptosis was increased in the spinal cord and MBP mRNA copy numbers were reduced. Additionally, cuprizonefeeding reduced the number of NogoA-positive oligodendrocytes in SJL-mice, but not C57BL/6-mice. The lack of myelin loss in the cervical and thoracic spinal cord of cuprizone fed mice substantiates the concept of major morphologic and most likely also of functional regional differences between brain and spinal cord. Possible mechanisms include site-specific susceptibilities to oxidative stress or cytokines, which might have major implication on the pathogenesis of demyelinating diseases. Data obtained of this part represented the basis for the investigation upon the influence of cuprizone on TMEV-induced spinal cord demyelination in the second part of the study. In order to verify the hypothesis, that cuprizone selectively inhibits the progressive course of TME, the influence of the toxin upon the spinal cord of SJL-mice was investigated in the second part of the study. The progressive clinical course of TME was significantly delayed as a result of a five-week cuprizone-feeding period. Until 10 weeks after removing cuprizone from the diet, animals with cuprizone-feeding and virus-infection show significantly better motor coordination compared to the virusinfected only group. Furthermore, animals with virus- and cuprizone-treatment displayed significantly reduced myelitis, demyelination, infiltration/activation of CD107b+ microglia/macrophages, CD45R+ B, CD3+ T cells and Foxp3+ regulatory T cells in the remyelination phase compared to virus-infected only mice. At the transcriptional level, mRNA copy numbers of pro- and anti-inflammatory cytokines (TNF-α, IL1-α, IL-2, IL-12, IL-23, IFN-γ, IL-4, IL-10 and TGF-β) were reduced in the cuprizone-fed and virus-infected animals in the late phase of the disease. TMEVinfected mice and animals with cuprizone-feeding and simultaneous virus-infection show no differences in axonal pathology. While a temporarily significant reduction of virus RNA copy numbers was detected, the amount of virus protein stayed at the same level. The results showed a reduced inflammatory response on protein and transcriptional levels due to cuprizone-feeding in TMEV-infected mice, which was associated with a transient improvement of clinical course despite continuous spread of TMEV and axon pathology. For the first time, results of the present study revealed that cuprizone is able to improve the clinical outcome and lesion progression in TME by reducing inflammatory responses and demyelination in the spinal cord without increasing virus replication. This novel aspect of cuprizone is a proposed consequence of selective inhibition of immune-mediated tissue damage or tissue preserving properties, respectively. The results of the present study might be of importance for further strategies to selectively reduce autoimmunity while maintaining antiviral immunity in inflammatory demyelinating disorders with a confirmed or suspected infectious etiology, such as MS or canine distemper.

Die Multiple Sklerose (MS) stellt eine der häufigsten Erkrankungen des zentralen Nervensystems von jungen Erwachsenen dar. Die Ursache dieser Erkrankung ist bis jetzt nicht geklärt. Derzeit werden allerdings verschiedene virale Infektionen in Betracht gezogen, welche die autoimmune Komponente der MS initiieren und infolge dessen eine Demyelinisierung in Gehirn und Rückenmark verursachen. Die aktuellen Therapiestrategien fokussieren sich auf eine Reduktion der Entzündung und dem damit verbundenen Gewebsschaden bei erkrankten Patienten. Die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis (TME) ist ein gut etabliertes, virusinduziertes Tiermodell für die MS und ermöglicht die Untersuchung von Therapiestrategien. Durch immunsuppressive Therapien wird die allgemeine antivirale Immunantwort vermindert und infolge dessen kommt es zu einer Virus-Ausbreitung und einer klinischen Verschlechterung der Tiere im TME-Modell. Aus diesem Grund ist es das Ziel der Studie gewesen, den Einfluss von Cuprizon auf den Verlauf der TME zu untersuchen. Es sollte festgestellt werden, ob die Cuprizon-Fütterung einen positiven Einfluss im Sinne einer Limitierung des Gewebsschades im zentralen Nervensystem hat oder ob es zu einer Exazerbation der Virusinfektion mit klinischer Verschlechterung kommt, wie dieses bei der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis gezeigt werden konnte. Das TME-Virus verursacht im Rückenmark eine entzündliche Demyelinisierung. Bisher lagen nur wenig Daten über Cuprizon-induzierte Effekte im Rückenmark vor. Deshalb wurde im ersten Teil der Studie der Einfluss der Cuprizon-Fütterung auf das Rückenmark untersucht. Basierend auf der Hypothese, dass die Gliazell-Verteilung und die toxininduzierten Schäden in verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems variieren, war es das Ziel, den Einfluss von Cuprizon auf die Myelin-Integrität bei SJL- und C57BL/6- Mäusen im Rückenmark im Vergleich zum Corpus callosum zu untersuchen. Die fünf-wöchige Cuprizon-Fütterung induzierte im Corpus callosum die erwartete Demyelinisierung. Im Rückenmark wurde allerdings mittels Luxol-Fast-Blue-Färbung, Immunhistologie (Myelin basisches Protein, Proteolipid Protein und 2’,3’-zyklische Nukleotid 3’-Phosphodiesterase) kein Myelinverlust in der weißen und grauen Substanz beider Mausstämme festgestellt. Darüber hinaus war kein Unterschied in der Anzahl der T- und B-Zellen sowie der Astrogliose im Rückenmark feststellbar. In SJL-Mäusen wurde nach Absetzen der Cuprizon-Fütterung eine erhöhte Anzahl von Mikroglia/Makrophagen mittels Immunhistolgie (CD107b) und RT-qPCR (CD11b) festgestellt. Der C57BL/6-Mausstamm zeigte keine Unterschiede in der Genexpression an allen untersuchten Zeitpunkten. Während der Frühphase der Cuprizon-Fütterung wurde eine erhöhte Apoptose-Rate im Rückenmark festgestellt, wohingegen die mRNS-Kopien des Myelin basischen Proteins signifikant reduziert waren. Auch die Anzahl der NogoA+ Oligodendrozyten war bei SJL-, nicht aber bei C57BL/6-Mäusen erhöht. Das Fehlen von Demyelinisierung im zervikalen und thorakalen Rückenmark bei Cuprizon-gefütterten Mäusen stellt das Prinzip großer morphologischer und wahrscheinlich auch funktioneller, regionaler Unterschiede zwischen Gehirn und Rückenmark heraus. Als Erklärung für diese Unterschiede kommen Regionen-spezifische Empfänglichkeiten gegenüber oxidativem Streß in Frage, die einen Einfluss auf die Pathogenese von demyelinisierenden Erkrankungen haben. Die Ergebnisse des ersten Teils dieser Studie stellen die Grundlage für den Einfluss von Cuprizon auf den Verlauf der TMEV-induzierten Demyelinisierung im zweiten Teil der Studie dar. Um die Hypothese zu verifizieren, dass Cuprizon selektiv den progressiven Verlauf der TME vermindert, wurde der Einfluss des Toxins auf die Progression der TMEVInfektion in SJL-Mäusen untersucht. Es wurde gezeigt, dass der progressive klinische Verlauf der TME mittels einer fünf-wöchigen Cuprizon-Fütterung signifikant verzögert wurde. Bis zu zehn Wochen nach Absetzen der Cuprizon-Fütterung zeigten TMEV-infizierte Mäuse eine signifikant verbesserte Motorkoordination im Vergleich zu Mäusen, die nur virusinfiziert waren. Darüber hinaus fand sich in den Mäusen mit Virusinfektion und Cuprizon-Fütterung eine signifikante Reduktion der Myelitis, Demyelinisierung und Infiltration mit CD107b+ Mikroglia/Makrophagen, CD45R+ B-Zellen, CD3+ T-Zellen und Foxp3+ regulatorischen T-Zellen im Vergleich zu virus-infizierten Mäusen ohne Cuprizon-Fütterung. Auf transkriptioneller Ebene wurde eine Reduktion der pro- und anti-inflammatorischen Zytokine (TNF-α, IL1-α, IL-2, IL-12, IL-23, IFN-γ, IL-4, IL-10 und TGF-β) bei virusinfizierten und cuprizongefütterten Mäusen im Vergleich zu ausschließlich virusinfizierten Tieren festgestellt. Die Untersuchung auf Axonopathien ergab keine Unterschiede in beiden Gruppen. Die Menge an Virusprotein war im Gegensatz zur Menge an viraler RNS nicht reduziert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Cuprizon-Fütterung zu einer Reduktion der Myelitis auf Protein- und Transkriptionsebene führt und mit einer temporären Verbesserung des klinischen Verlaufs assoziiert ist, obwohl eine kontinuierliche Ausbreitung des Virus und sowie des axonalen Schadens vorliegt. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass Cuprizon die Progression der TME durch eine reduzierte Entzündungszellinfiltration und Demyelinisierung im Rückenmark abmildert und dass dabei keine Virusexazerbation stattfindet. Dieser neue Aspekt von Cuprizon ist möglicherweise Folge einer selektiven Hemmung des immunmediierten Gewebsschadens. Die Ergebnisse dieser Studie stellen einen wichtigen Beitrag zur selektiven Hemmung der Autoimmunität bei erhaltener anti-viraler Immunantwort bei entzündlich-demyelinisierenden Erkrankungen mit einer nachgewiesenen oder vermuteten infektiösen Ursache, wie der MS oder der kaninen Staupe, dar.

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Herder, Vanessa: The impact of cuprizone on the murine spinal cord and the progrssion of Theiler's murine encephalomyelitis. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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