Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effekte von Sphingosin-1-Phosphat und Analoga auf die Entzündungsreaktion und epidermale Hyperproliferation in Modellen der Psoriasis

Schaper, Katrin

Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a biological mediator, which has been implicated in many physiological cell functions. In the present study the influence of S1P, S1P receptor agonists (FTY720, FTY720P, SEW2871) and antagonists (W146, JTE-013) on the cytokine profile of murine dendritic cells and murine keratinocytes was investigated. Furthermore, the in vivo efficacy of locally administered S1P and FTY720 was tested in the imiqumiod-induced psoriasis model, as well as in the mouse-tail-assay, since the strategy of targeting the migratory response of Langerhans cells with locally acting S1P, which also inhibits keratinocyte proliferation, represents a new option for the treatment of psoriasis vulgaris. The in vitro experiments were carried out with bone marrow derived dendritic cells from BALB/c mice and murine keratinocytes (MSC-P5). Initially, the presence of the S1P-receptor 1, 2 and 3 was examined by means of PCR. As expected, dendritic cells expressed the mRNA of S1P-receptors 1, 2 and 3 while only the S1P-receptors 1 and 2 were detected in murine keratinocytes. In cell culture experiments dendritic cells were incubated with S1P, FTY720 and FTY720P and subsequently stimulated with toll like receptor agonist LPS. In the supernatants the concentration of IL-12, -23 and -27 were determined by means of ELISA. Pre-treatment of DC with S1P markedly reduced the LPS-mediated secretion of IL-12 and IL-23 in a dose dependent manner, whereas it partially enhanced the secretion of IL-27. For FTY720 and FTY720P there were only slight effects on cytokine production. To evaluate which receptor subtype is responsible for this pattern of cytokine modulation, experiments using the S1PR1-agonist SEW2871, the S1PR1-antagonist W146, as well as the S1PR2-antagonist JTE-013 were performed. SEW2871 reduced the cytokine secretion to the same extend as S1P. Pre-treatment of DC with the S1PR1-antagonist W146 blocked this inhibition, while treatment with the S1PR2-antagonist JTE-013 had no effect. So, it is likely that S1PR1 is the main receptor mediating the modulation of cytokine production. It was further tested, if S1P had any influence on the cross talk between dendritic cells and keratinocytes, since these two cell types are crucial for the initiation and maintenance of psoriasis. Again, in this setting S1P reduced cytokine production in DC, which were activated by the stimulated keratinocytes. In contrast the preincubation of keratinocytes with S1P showed no effect. In a combined in-vivo/ex-vivo study the impact of S1P on the antigen uptake by dendritic cells was investigated, because antigen uptake is a key event in immunological processes and has recently been discussed also as an important parameter in the pathogenesis of psoriasis. This experiment showed a markedly reduced uptake of FITC-dextran by Langerhans cells in the epidermal layer of mice ears, which were pre-treated with S1P. The in vivo influence of S1P and FTY720 was tested in the imiquimod (IMQ)-induced psoriasis model. The psoriasis area and severity index (PASI), the mouse-earswelling-test, the local lymph node reaction (weight and total cell number), the IL-17 and IL-23 production in ear homogenate, as well as histological analysis of the epidermal back and ear skin were evaluated as parameters. Application of IMQ creme to mouse back skin and ear skin induced inflammation, characterized by erythema, scaling and lichenification of the back skin, as well as a marked swelling of the ear. While both, S1P and FTY720 had no impact on the phenotypical and histological changes at the back skin of mice, S1P significantly reduced the ear swelling. Furthermore, S1P and FTY720 decreased weight and total cell number of the draining auricular lymph node. The epidermal hyperproliferation of the ear was also attenuated by topically administered S1P. Whereas the IL-23 secretion in the ear was too low for quantification, FTY720 elicited a strong decrease in IL-17 production. S1P showed no effect on this parameter. The second in-vivo study, the mouse tail assay, offers the opportunity to examine the effect of test agents on the differentiation of keratinocytes. In contrast the positive control calcipotriol, S1P as well as FTY720 exhibited no effect. In summary, this study implicates, that S1P has an anti-inflammatory impact on various immunological reactions. S1P modulates the cytokine profile of dendritic cells, with a reduced TH1 dominated response. In addition to the inhibition of antigen uptake and the general anti-inflammatory effect in vivo S1P also reduces epidermal proliferation. This suggests that the topical use of S1P might represent a novel option for the treatment of psoriasis vulgaris.

Sphingosin-1-Phosphat (S1P) ist ein biologisch aktiver Mediator, der eine Vielzahl physiologischer Zellfunktionen moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von S1P, von S1P-Rezeptor-Agonisten (FTY720, FTY720P, SEW2871) sowie -Antagonisten (W146, JTE-013) auf das Zytokinprofil muriner dendritischer Zellen und muriner Keratinozyten untersucht. Die Strategie, die Migration der Langerhanszellen mit lokal wirksamem S1P zu reduzieren, welches zusätzlich die Keratinozytenproliferation hemmt, stellt eine bisher nicht untersuchte Möglichkeit in der Behandlung der Psoriais vulgaris dar. Deshalb wurde weiterhin die Wirkung von lokal appliziertem S1P und FTY720 im Imiquimod-induzierten Psoriasis-Modell der Maus sowie im Mouse-Tail-Assay getestet. Für die In-vitro-Versuche wurden dendritische Zellen aus dem Knochenmark von BALB/c-Mäusen generiert und murine Keratinozyten der Zelllinie MSC-P5 verwendet. Es wurde zunächst mittels PCR der Nachweis der S1P-Rezeptoren 1, 2 und 3 auf mRNA-Ebene durchgeführt. Wie erwartet, exprimierten die DC die S1P-Rezeptoren 1, 2 und 3, während auf den murinen Keratinozyten nur der S1P-Rezeptor 1 und 2 nachgewiesen werden konnte. In Zellkulturexperimenten wurde dann nach Präinkubation der DC mit S1P, FTY720 und FTY720-Phosphat und anschließender Stimulation mit dem Toll-like-Rezeptor-Agonisten LPS, in den Überstanden die Konzentrationen von IL-12, IL-23 und IL-27 mittels ELISA bestimmt. S1P war in der Lage die IL-12- und IL-23-Sekretion konzentrationsabhängig zu hemmen. Die IL-27-Sekretion wurde durch S1P in einigen Versuchsansätzen erhöht, blieb in anderen aber unverändert. FTY720 und FTY720P zeigten nur tendenzielle Effekte auf die Zytokinproduktion. Um zu evaluieren über welchen Rezeptorsubtyp die Effekte beeinflusst wurden, erfolgten Versuche mit dem S1PR1-Agonisten SEW2871, dem S1PR1-Antagonsiten W146 sowie dem S1PR2-Antagonisten JTE-013. SEW2871 konnte die Zytokinsekretion in gleichem Maße hemmen wie S1P. Diese Hemmung wurde durch die Inkubation der Zellen mit dem S1PR1-Antagonisten W146 antagonisiert, während bei der Behandlung mit dem S1PR2-Antagonisten JTE-013 kein Unterschied zu detektieren war. Aus diesen Daten lässt sich schlussfolgern, dass ein Großteil der Zytokinproduktion bei dendritischen Zellen über den S1P-Rezeptor 1 moduliert wird. Nachfolgend wurde getestet, inwieweit S1P Einfluss auf die Interaktion zwischen DC und Keratinozyten nehmen kann, da diese beiden Zelltypen in der Pathogenese der Psoriasis eine bedeutende Rolle spielen. S1P konnte auch hier die Zytokinsekretion der durch die Keratinozyten aktiverten DC hemmen. Dies war wiederum deutlich zu erkennen an einer Verminderung der Konzentrationen von IL-12 und IL-23. Die anschließende Präinkubation der Keratinozyten mit S1P hingegen blieb wirkungslos. In einer kombinierten In-vivo/Ex-vivo-Studie wurde der Einfluss von S1P auf die Antigenaufnahme dendritischer Zellen untersucht, da dies ein Schlüsselereignis in der Entzündungsreaktion darstellt und auch in der Psoriasis in jüngster Zeit als ein bedeutender Faktor diskutiert wird. Der Versuch zeigte, dass die Aufnahme von FITC-Dextran durch Langerhanszellen in der Ohrepidermis von Mäusen durch S1P signifikant reduziert werden kann In vivo wurde die Wirkung von S1P und FTY720 zunächst im Imiquimod-induzierten Entzündungsmodell der Maus untersucht. Als Parameter dienten der Psoriasis Area and Severity Index (PASI), der Mouse-Ear-Swelling-Test zur Bewertung einer entzündlichen Ohrschwellung, die Reaktion im regionalen Lymphknoten, bezüglich des Gewichtes und der Gesamtzellzahl, die IL-17- und IL-23-Konzentrationen im Ohrhomogenat sowie histologische Untersuchungen der Ohr- und Rückenhaut, bei denen ein besonderer Fokus auf der Keratinozytenproliferation lag. Durch das Auftragen der Imiquimodcreme auf die Rücken und die Ohren der Mäuse wurde eine Entzündungsreaktion ausgelöst, gekennzeichnet durch Rötung, Schuppenbildung und Lichenifikation der Rückenhaut sowie durch eine deutliche Entzündungsreaktion der Ohren. Während sowohl S1P, als auch FTY720 auf die phänotypischen und histologischen Veränderungen am Rücken der Tiere keinen Einfluss zeigten, konnte S1P die Entzündungsreaktion am Ohr hinsichtlich der Schwellung signifikant hemmen. Weiterhin reduzierten S1P und FTY720 das Gewicht und die Zellzahl der regionalen Lymphknoten (Lnn. auriculares). Auch in Bezug auf die Keratinozytenproliferation übte S1P hemmenden Einfluss am Ohr aus. Während die IL-23-Konzentration im Ohr aufgrund zu geringer Menge nicht bewertet werden konnte, zeigte FTY720 bei der IL-17-Konzentration eine deutliche Reduzierung. S1P hatte dort keinen Effekt. Die zweite In-vivo-Studie, der Mouse-Tail-Assay, ermöglicht es Effekte der Testsubstanzen auf die Differenzierung der Keratinozyten zu untersuchen. Im Gegensatz zu der Positivkontrolle Calcipotriol konnte kein Einfluss von S1P und FTY720 festgestellt werden. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass S1P einen antiinflammatorischen Einfluss auf eine Reihe von immunologischen Reaktionen im Organismus aufweisen kann. Die Modulation des Zytokinprofils dendritischer Zellen mit einer reduzierten TH1-Antwort sowie die Hemmung der Antigenaufnahme und den allgemein entzündungshemmenden Effekten im Tiermodel, bei gleichzeitiger Reduzierung der Keratinozytenproliferation, lassen vermuten, dass der topische Einsatz von S1P eine mögliche Option in der Behandlung der Psoriasis vulgaris darstellen könnte. 

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Schaper, Katrin: Effekte von Sphingosin-1-Phosphat und Analoga auf die Entzündungsreaktion und epidermale Hyperproliferation in Modellen der Psoriasis. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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