Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studies on the prevalence, distribution and organization of extended-spectrum β-lactamase genes and transferable (fluoro)quinolone resistance genes among Enterobacteriaceae from defined disease conditions of companion and farm animals

Schink, Anne-Kathrin

Extended-spectrum β-lactamase (ESBL)- and Qnr-protein-producing Escherichia coli isolates have gained considerable public attention during recent years. However, information about such isolates from diseased animals in Germany is scarce. Thus, the aims of this study were (i) to determine how often and which subtypes of ESBL and qnr genes are present in E. coli from defined disease conditions of companion and farm animals and (ii) to gain insight into the location and organization of the resistance genes. For this, the E. coli isolates collected all over Germany in the BfT-GermVet study were used. In the BfT-GermVet study, 417 E. coli isolates from diseased dogs/cats (n = 228), horses (n = 102), and swine (n = 87) were tested for their susceptibility to 24 antimicrobial agents by broth microdilution. To identify potential ESBL-producers, all 100 ampicillin-resistant E. coli isolates from this collection were subjected to an initial screening for cefotaxime resistance and subsequent phenotypic confirmatory tests. In a second part of the project, all E. coli isolates were screened for qnr genes. The ESBL and qnr genes were detected by specific PCR assays and the complete resistance genes including their flanking regions were cloned and sequenced. Plasmids were transferred by conjugation and transformation into E. coli recipients and subjected to PCR-based replicon typing. One qnrB19-carrying plasmid was sequenced completely. Multilocus sequence typing (MLST) was performed for the ESBL-producing and for the qnr-positive E. coli isolates. Solely three E. coli isolates showed an ESBL phenotype. The canine isolate 913 from a urinary tract infection harboured a blaCTX-M-15 gene and the E. coli isolates from canine pneumonia (isolate 168) and porcine metritis-mastitis-agalactia syndrome (isolate 246) blaCTX-M-1 genes. The gene qnrB19 was detected in two E. coli isolates (2078 and 2086) from mares suffering from genital tract infections. MLST showed that isolate 913 had the sequence type ST410, while isolates 168 and 246 belonged to the novel sequence types ST1576 and ST1153, respectively. Isolates 2078 and 2086 were assigned to ST86. Isolate 913 harboured the ca. 50 kb IncF plasmid pCTX913. This plasmid carried the blaCTX-M-15 gene and an aac(6’)-Ib-cr gene, which confers resistance to kanamycin and reduced susceptibility to ciprofloxacin. Furthermore, pCTX913 conferred resistance to gentamicin and tetracycline. Upstream of blaCTX-M-15 the insertion sequence ISEcp1 was present and downstream a truncated orf477 and a fragment of a transposase gene tnpA. The two blaCTX-M-1 ESBL genes were located on structurally related plasmids of ca. 50 kb which did not confer any other resistance properties. PCR-based replicon typing identified both plasmids designated pCTX168 and pCTX246, to belong to IncN. Plasmid pCTX168 was conjugative. The blaCTX-M-1 upstream and the immediate downstream regions of pCTX168 and pCTX246 were similar whereas the sequences further downstream of blaCTX-M-1 differed. In the upstream region, a fragment of the insertion sequence ISEcp1, truncated by an IS26 element, was detected. In the downstream region, a fragment of orf477 and a truncated mrx gene were identified on both plasmids. On plasmid pCTX246, a complete mph(A) gene and another IS26 element were seen further downstream of the Δmrx gene, while on plasmid pCTX168 the mph(A) gene was truncated. The qnrB19-carrying conjugative plasmids pQNR2078 and pQNR2086 belonged also to IncN, were indistinguishable by restriction analysis and did not carry other resistance genes. The qnrB19 gene was flanked by copies of the insertion sequence IS26 located in the same orientation. The completely sequenced plasmid, pQNR2078, had a size of 42,379 bp and exhibited 47 open reading frames. Except for the resistance gene region, the remaining part of pQNR2078 showed 99% nucleotide sequence identity to the blaCTX-M-65-carrying plasmid pKC396 from human E. coli. The blaCTX-M-15 gene region as identified on the IncF plasmid pCTX193 has been detected in diverse plasmid backgrounds in different members of the Enterobacteriaceae from human and animal sources isolated in several countries. In addition, the gene blaCTX-M-1 gene in combination with the IS26-ΔISEcp1-structure, the truncated mph(A)-mrx-mphR(A) gene cluster which is followed by a second IS26, linked to IncN plasmids has been described in a German human clinical E. coli ST131 isolate, but not in isolates of animal origin in Germany so far. The gene qnrB19 gene was detected in a new genetic environment on conjugative IncN plasmids and for the first time in an E. coli isolate of equine origin in Germany. Despite the fact, that the number of blaCTX-M and qnr genes among E. coli from the BfT-GermVet study was low, the results of this study showed that the integration of insertion sequences and interplasmid recombination events accounted for the structural variability of the blaCTX-M gene regions and the formation of the genetic environment of qnrB19 on pQNR2078. Furthermore, IncN plasmids, which carry blaCTX-M-1 or qnrB19 genes, might be involved in the dissemination of these resistance genes among Enterobacteriaceae of animal and human origin.

In der jüngeren Vergangenheit sind Escherichia coli-Isolate, die Gene für β-Laktamasen mit erweitertem Wirkungsspektrum (extended-spectrum β-lactamase; ESBL) und/oder Qnr-Proteine tragen und so Resistenz gegenüber Penicillinen, Cephalosporinen und Monobaktamen beziehungsweise (Fluor)Chinolonen zeigen, zunehmend in den Fokus des öffentlichen Interesses gelangt. Da es über diese Gene bei E. coli-Isolaten von erkrankten Tieren in Deutschland nur wenig Informationen gibt, waren die Ziele dieser Studie festzustellen (i) wie häufig und welche Gene für ESBLs und Qnr-Proteine bei E. coli Isolaten von erkrankten Kleintieren und Nutztieren zu finden sind und (ii) die genetische Lokalisation und Organisation dieser Gene zu untersuchen. Hierzu wurde das Stammkollektiv der deutschlandweit durchgeführten BfT-GermVet Studie verwendet. In der BfT-GermVet Studie wurden für 417 E. coli-Isolate von erkrankten Hunden/Katzen (n = 228), Pferden (n = 102) und Schweinen (n = 87) minimale Hemmkonzentrationen gegenüber 24 antimikrobiellen Wirkstoffen mittels Bouillonmikrodilution bestimmt. Von diesen 417 E. coli-Isolaten zeigten 100 Resistenz gegenüber Ampicillin. Um potentielle ESBL-Produzenten zu identifizieren, wurden zusätzlich die minimalen Hemmkonzentrationen für Cefotaxim bestimmt und anschließend phänotypische Bestätigungstests durchgeführt. Alle E. coli-Isolate wurden auf das Vorhandensein von qnr-Genen untersucht. Die ESBL- und qnr-Gene wurden mittels spezifischer PCR-Assays detektiert und die vollständigen Gene inklusive ihrer flankierenden Regionen kloniert und sequenziert. Plasmide wurden über Konjugation oder Transformation in E. coli-Empfängerstämme transferiert und mit PCR-basierter Replikontypisierung charakterisiert. Für die ESBL-produzierenden und qnr-positiven E. coli-Isolate wurde Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) durchgeführt. Lediglich bei drei E. coli-Isolaten wurde ein ESBL-Phänotyp festgestellt. Ein Isolat stammte von einem Hund mit Harnwegsinfektion (Isolat 913), eines von einem Hund mit Pneumonie (Isolat 168) und das dritte von einer Sau mit Mastitis-Metritis-Agalaktie Syndrom (Isolat 246). Isolat 913 beherbergte das ESBL-Gen blaCTX-M-15 und Isolate 168 und 246 je ein blaCTX-M-1. In zwei E. coli-Isolaten (Isolate 2078 und 2086) von Stuten mit Genitalinfektionen wurde das Gen qnrB19 identifiziert. Über MLST wurde für Isolat 913 der bekannte ST410 bestimmt  und die Isolate 168 und 246 den neuen Sequenztypen ST1576 und ST1153 zugeordnet. Die Isolate 2078 und 2086 wiesen den Sequenztyp ST86 auf. Isolat 913 beinhaltete das ca. 50 kb IncF-Plasmid pCTX913 mit den Genen blaCTX-M-15 und aac(6’)-Ib-cr – letzteres Gen vermittelt Resistenz gegenüber Kanamycin und verminderte Empfindlichkeit gegenüber Ciprofloxacin. Des Weiteren vermittelte pCTX913 auch Resistenz gegenüber Gentamicin und Tetrazyklin. In der stromaufwärts von blaCTX-M-15 gelegenen Region befand sich die Insertionssequenz ISEcp1 und stromabwärts ein Fragment von orf477 sowie ein Fragment eines Transposasegenes tnpA. Die blaCTX-M-1ESBL-Gene waren auf strukturell ähnlichen ca. 50 kb-großen Plasmiden der Inkompatibilitätsgruppe IncN lokalisiert (pCTX168 und pCTX246), die neben der β-Laktamresistenz keine weiteren Resistenzen aufwiesen. Das Plasmid pCTX168 erwies sich als konjugativ. Der Bereich stromaufwärts von blaCTX-M-1 war bei beiden Plasmiden gleich und bestand aus einem Fragment der Insertionssequenz ISEcp1, welche von einer Insertionssequenz des Typs IS26 unterbrochen wurde. Stromabwärts des blaCTX-M-1-Genes wurden ein Fragment des offenen Leserahmens orf477 und ein partiell deletiertes mrx-Gen ebenfalls auf beiden Plasmiden gefunden. Weiter stromabwärts unterschieden sich die Sequenzen der beiden Plasmide dagegen voneinander. Auf pCTX246 wurden ein vollständiges mph(A)-Gen und ein weiteres IS26 identifiziert, während auf pCTX168 das Gen mph(A) partiell deletiert war. Die qnrB19-tragenden IncN-Plasmide pQNR2078 und pQNR2086, erwiesen sich als konjugativ, waren durch Restriktionsanalysen nicht zu unterscheiden und vermittelten keine weiteren Resistenzen. Die qnrB19-Gene waren von zwei, in gleicher Orientierung angeordneten Kopien der Insertionssequenz IS26 flankiert. Das Plasmid pQNR2078 wurde vollständig sequenziert. Es hatte eine Größe von 42,379 bp und verfügte über 47 offene Leserahmen. Vergleichende Analysen ergaben – abgesehen von der Resistenzgenregion – eine Identität von 99% zu dem blaCTX-M-65-tragenden Plasmid pKC396 von einem E. coli-Isolat menschlicher Herkunft. Die Umgebung des auf dem IncF Plasmid pCTX913 lokalisierten blaCTX-M-15-Genes ist bereits auf verschiedenen Plasmiden in unterschiedlichen Vertretern der Familie Enterobacteriaceae menschlichen oder tierischen Ursprungs aus verschiedenen Ländern beschrieben worden. In E. coli-Isolaten tierischer Herkunft wurde das blaCTX-M-1 Gen in Kombination mit der IS26-ΔISEcp1-Struktur und einem partiell deletierten mph(A)-mrx-mphR(A)-Genkomplex, dem ein zweites IS26 folgt, auf einem IncN- Plasmid bisher noch nicht identifiziert. Allerdings wurde diese Struktur bislang bei einem klinischen E. coli ST131-Isolat von einem Menschen aus Deutschland nachgewiesen. Das qnrB19-Gen liegt in einem bisher unbekannten genetischen Kontext auf konjugativen IncN-Plasmiden und wurde im Rahmen dieser Ph.D.-Arbeit zum ersten Mal bei E. coli-Isolaten von Pferden aus Deutschland identifiziert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass ESBL- und qnr-Gene bei E. coli-Isolaten von erkrankten Tieren aus der BfT-GermVet-Studie relativ selten vorkommen. Weiterhin zeigten die Untersuchungen zur Feinstruktur der Resistenzgenregionen, dass die Integration von Insertionssequenzen und Rekombinationen zwischen Plasmiden die strukturelle Variabilität der blaCTX-M-Regionen und die Entstehung der genetischen Umgebung von qnrB19 auf dem Plasmid pQNR2078 bedingt haben. Darüber hinaus sind IncN-Plasmide, die Gene wie blaCTX-M-1 oder qnrB19 tragen, wahrscheinlich an der Verbreitung dieser Resistenzgene unter Enterobacteriaceae von Menschen und Tieren beteiligt.

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Schink, Anne-Kathrin: Studies on the prevalence, distribution and organization of extended-spectrum β-lactamase genes and transferable (fluoro)quinolone resistance genes among Enterobacteriaceae from defined disease conditions of companion and farm animals. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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