Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung funktioneller Membranparameter bei im Niedrigtemperaturbereich flüssig konservierten Eberspematozoen

Schmid, Susanne

The aim of the present study was to test in a kinetic approach, whether the ability of preserved boar spermatozoa to respond to capacitating stimuli is a sensitive tool to detect an influence of storage temperature, storage length and extender. Furthermore, the effect of different storage conditions on the thermotropic membrane phase behavior of boar spermatozoa was assessed. An insemination trial was carried out to correlate the results of in vitro experiments with fertility in vivo. In a first experiment seven normospermic ejaculates of seven boars were diluted split sample with Beltsville Thawing Solution (BTS, Fa. Minitüb, Tiefenbach) and kept for 3 h at 22°C or cooled down to 17, 10 and 5°C and stored up to 96 h. After 3 h (22°C) as well as after 24 and 96 h preserved samples were checked for motility (using the CASA-system Sperm VisionTM) and integrity of plasma and acrosomal membranes (double staining with propidium iodide and FITC-PNA). Additionally, the functional membrane parameters influx of extracellular calcium (Fluo-3) and phospholipid disorder (merocyanine 540) were assessed during incubation in well defined capacitation (Tyrode) and control media. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was utilized for determining the membrane phase transition temperature. Even though the standard quality traits, motility and membrane integrity, dropped with decreasing storage temperature and -to less extent- increasing storage time, percentages of sperm were at high levels within the range of 60-70 % recommended for AI use. The amount of destabilized cells (sum of Fluo-3-pos. and PI-pos.) at the begin of incubation under (non)-capacitating conditions increased in relation to storage temperature, being highest in samples stored at 5°C (p < 0.05). The responsiveness to incubation conditions was calculated as the difference between the percentage of sperm at a representative timepoint during incubation and at the onset of incubation in capacitating (Tyrode∆60-3) and control (control∆60-3) medium. For determining the specific reactivity to capacitating stimuli the difference between the responsiveness in the proportion of live cells with basic intracellular calcium content (PI-neg./Fluo-3-neg.) in Tyrode and control medium was calculated. Specific reactivity was markedly reduced in relation to temperature and duration of storage. On one hand, this effect was due to an increasing destabilization and therefore decreasing life time of a sperm subpopulation; on the other hand, an increasing proportion of sperm cells had become refractory because of the storage conditions and was no longer capable of responding to capacitating stimuli. Regarding phospholipid disorder, only at begin of incubation an increase of reactive cells was observed. For boar sperm stored under various conditions, the temperature range in which membrane phase transition from liquid in gel state takes place was between 30 and 10°C. Even storage for 96 h at 5°C did not change sperm membrane phase behavior, indicating that storage conditions did not have a marked effect on lipid composition and organization of sperm membranes. In a second experiment, the sensitivity of the specific reactivity parameter for detecting effects of extender on boar sperm preserved at lower temperatures was tested. For that purpose seven ejaculates were diluted split sample with BTS or Androstar® Plus (Fa. Minitüb, Tiefenbach). Samples were cooled and examined according to experiment one. After 24 and 96 h of storage, specific reactivity of cold-shocked spermatozoa (10°C, 5°C) was higher in samples diluted with Androstar® Plus as compared to BTS-diluted samples (p < 0.05). Androstar® Plus-diluted samples stored at 10°C attained a similar specific reactivity as compared to samples diluted with BTS and stored at 17°C. To test the hypothesis, these variants would not differ in fertility in vivo, 83 ejaculates of 30 boars diluted split sample and stored up to 48 h were used for artificial insemination of 778 sows. Between the two groups, there was no difference in pregnancy and farrowing rates as well as in the number of total and live born piglets. In conlusion, the specific reactivity to capacitating stimuli is a sensitive functional membrane parameter for detecting the effects of cooling, storage length and extender on liquid preserved boar spermatozoa.

Ziel der vorliegenden Studie war es, in kinetischen Testsystemen zu prüfen, ob die Reaktionsfähigkeit auf Kapazitationsstimuli bei im Niedrigtemperaturbereich konservierten Spermien geeignet ist, Einflüsse von Lagerungstemperatur, -zeit und Verdünnermedium darzustellen, die mittels der routinemäßig erfassten Qualitätsparameter nicht detektierbar sind. Weiterhin wurde der Einfluss von unterschiedlichen Lagerungsbedingungen auf das Membranphasenverhalten der Spermatozoen untersucht. Ein Besamungsversuch wurde durchgeführt, um die im Labor gewonnenen Erkenntnisse mit der Fertilität in vivo in Beziehung zu setzen. In einem ersten Versuchsteil wurden sieben normosperme Ejakulate von sieben Ebern im split sample-Verfahren mit Beltsville Thawing Solution (BTS, Minitüb, Tiefenbach) verdünnt und für 3 h bei 22°C gehalten oder bei 17, 10 und 5°C für bis zu 96 h gelagert. Nach 3 h (22°C) sowie nach 24 und 96 h wurden die konservierten Proben hinsichtlich ihrer Motilität (mittels des CASA-Systems Sperm VisionTM) und der Integrität der Plasma- und Akrosommembranen (kombinierte Färbung mit Propidiumjodid und FITC-PNA) untersucht. Die funktionellen Membranparameter Calciuminflux (Fluo-3-Farbstoff) und Phospholipidumorientierung (Merocyanin 540) wurden während der Inkubation in definierten Kapazitations- (Tyrode) und Kontrollmedien erfasst. Die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) wurde verwendet, um das Membranphasenverhalten der Spermien zu erfassen. Obwohl die Standardparameter Motilität und Membranintegrität in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur und -in geringerem Ausmaß- der Lagerungsdauer abnahmen, lagen sie auf relativ hohem Niveau im Bereich der für die Nutzung zur künstlichen Besamung empfohlenen Mindestanforderungen von 60-70 %. Der Anteil destabilisierter Zellen (Summe aus Fluo-3-positiven und PI-positiven) zu Beginn der Inkubation nahm temperaturabhängig zu (p < 0,05), wobei der jeweils höchste Anteil in den bei 5°C gelagerten Proben auftrat. Die Reaktivität auf die Inkubationsbedingungen wurde durch Bildung der Differenz aus einem ausgewählten, repräsentativen Zeitpunkt während der Inkubation und dem Anfangszeitpunkt der Inkubation im Kapazitationsmedium (TyrodeΔ60-3) und im Kontrollmedium (KontrolleΔ60-3) bestimmt. Um die spezifische Reaktivität auf kapazitationsfördernde Stimuli zu ermitteln, wurde die Differenz aus der Reaktivität im Tyrode- und im Kontrollmedium in der Population der lebenden Spermien mit niedrigem intrazellulärem Calciumgehalt (PI-neg./Fluo-3-neg.) gebildet. Die spezifische Reaktivität nahm in enger Beziehung zu Lagerungstemperatur und -zeit ab. Zu diesem Effekt trugen zum einen eine zunehmende Destabilisierung und damit verkürzte Lebensdauer einer Spermiensubpopulation bei; zum anderen war ein Anstieg der Subpopulation von Spermien, welche durch die Lagerungsbedingungen refraktär gegenüber den kapazitationsfördernden Reizen geworden war, zu beobachten. Hinsichtlich der Neuorientierung der Phospholipide war lediglich zu Beginn der Inkubation eine zunehmende Subpopulation reaktiver Spermien zu bemerken. Mittels FTIR konnte der Übergang der Spermienmembranen von der flüssigen in die gelförmige Phase einem Bereich zwischen 30 und 10°C zugeordnet werden. Die Lagerung bis zu 96 h bei 5°C bewirkte keine Unterschiede im Membranphasenverhalten der Spermien; die Konservierung der Spermatozoen hatte offensichtlich keinen hochgradigen Effekt auf die Lipidzusammensetzung und Organisation der Zellmembranen. Im zweiten Versuchsteil wurde die Sensitivität des spezifischen Reaktionsparameters zur Darstellung von Verdünnereinflüssen bei im Niedrigtemperaturbereich konservierten Eberspermien untersucht. Dazu wurden sieben Ejakulate im split sample-Verfahren mit BTS und Androstar® Plus verdünnt und wie in Versuchsteil eins abgekühlt und untersucht. Nach 24 und 96 h wiesen die kältegestressten Spermien (10°C, 5°C) in Androstar® Plus eine höhere (p < 0,05) spezifische Reaktivität auf als die Spermien der BTS-Proben. Androstar®Plus-verdünnte, bei 10°C gelagerte und bei 17°C in BTS gelagerte Spermatozoen erzielten eine ähnlich hohe spezifische Reaktivität. Um die Hypothese zu testen, dass diese Varianten sich nicht in der Fertilität in vivo unterscheiden, wurden 83 split sample-verdünnte, bis zu 48 h gelagerte Ejakulate von 30 Ebern für die Besamung von 778 Sauen verwendet. Zwischen den beiden Besamungsgruppen bestand kein Unterschied in Trächtigkeitsrate (Ultrasonographie Tag 40), Abferkelrate, Anzahl der gesamt und lebend geborenen Ferkel. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass die spezifische Reaktivität auf kapazitierende Stimuli einen sensitiven, funktionellen Membranparameter zur Erfassung der Einflüsse von Abkühlung, Dauer der Lagerung und Verdünnermedium bei flüssig konservierten Eberspermien darstellt.

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Schmid, Susanne: Charakterisierung funktioneller Membranparameter bei im Niedrigtemperaturbereich flüssig konservierten Eberspematozoen. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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