Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Cellular factors modulating the entry efficiency of West Nile virus

Schmidt, Katja

West Nile virus (WNV) constitutes a major public health concern considering the changing environment, climate changes, worldwide travel and global trade. An increasing number of outbreaks has been reported for Europe during recent years. Understanding the basic mechanisms of host cell infection will contribute to the knowledge of WNV pathogenesis, transmission and species susceptibility, and help to encounter this global threat in terms of prevention, control and treatment strategies. Identification of receptors and molecules involved in WNV entry is of fundamental importance since the early interaction with the host cell does not only determine cell susceptibility but may also contribute to the exceptionally broad host tropism of WNV. The integrin αvb3 had been postulated earlier to function as a receptor for WNV; however, its involvement in WNV entry has been doubted recently. In this context, the present study was designed to clarify the involvement of integrins in WNV entry. Additional questions were addressed as to their role, the extent to which they participate in virus entry, and to possible differences in the binding or entry efficiencies in distinct WNV strains. A cell culture model was established, based on specific integrin knock-out cell lines, in order to investigate the susceptibility of these cells to WNV. Wild type, integrin αv-deficient, b3-deficient and αv/b3 double-knock-out mouse embryonic fibroblasts were isolated from 12.5 days old embryos which possess a specific modification in the particular integrin subunit genomic sequence. The MEF cell lines were cultured and characterised for their integrin expression patterns by immuno-fluorescence staining and for their expression levels by flow cytometry analysis. Additionally, integrin b1-deficient mouse kidney fibroblasts and the parental cell line were included in the study. In a parallel approach wild type and integrin deficient cell lines were infected with four WNV strains. Efficiency of binding and of internalisation in terms of virus yields was assayed separately by determination of genome containing virus particle numbers. Furthermore, the involvement of cell-associated heparan sulfate as an attachment factor was investigated. The use of two cell types, Lcells (mouse cells from connecting tissue) and CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary cells), and their glycosaminoglycan- or heparan sulfate-deficient derivatives allowed comparisons of binding and replication efficiencies. The major conclusions drawn from the experiments are as follows: (i) The presence of either αv, b1 or b3 integrins on cell surfaces is not a requirement for a successful WNV infection of the mouse fibroblasts. All four WNV strains were capable to replicate in the integrin deficient cell lines. However, the replication efficiency in β3-deficient cells was substantially lower than in wild type mouse embryonic fibroblasts. Therefore, a rescue of the b3 integrin subunit was introduced into the integrin β3-deficient cell line (refer to results in indent ii, iii). (ii) The hypothesis from the early literature that integrins function as receptors mediating both virus binding and internalisation in an integrated step is rejected. Efficiency of virus attachment to cell surfaces of integrin deficient cells was comparable to that of integrin expressing cells. Moreover, blocking antibodies against b1 and b3 integrin subunits failed to interfere with virus binding to specifically β1 or β3 integrin expressing cells, and had no effect on the infection outcome. (iii) Integrin expression positively affects virus yields as seen in integrin b3 rescue and integrin b1-floxed cells in comparison to the corresponding integrin deficient cell line. At which stage in virus entry or during post-entry integrins intervene is not clear. Due to the surface localisation of integrins, a functioning at the level of virus internalisation is suggested, either by mediating endocytosis or by interacting with other unidentified surface receptors in terms of activation or inhibition, or by modification of these proteins, the latter may result in an improved accessibility for the virus. (iv) Differences among the four WNV strains used in this study do not affect the usage of β1 and b3 integrins during entry and/or replication. (v) Rescue of the integrin b3 subunit in CHO-K1 cells, and constitutive expression of integrin αvb3 does not result in permissiveness of these cells for WNV. Hence, it is assumed that another surface protein is necessary which facilitates virus internalisation, either in cooperation with or independently from integrin αvβ3. Furthermore, efficiency of binding to CHO-K1 cells was essentially the same as seen in other cells. This indicates, in agreement to other findings of the study (see indent ii), that integrin αvb3 does neither mediate binding of WNV to the cell surface nor internalisation in a self-contained process. (vi) Heparan sulfate serves as a possible attachment factor for WNV but accounts only for a limited portion of virus attachment. The synopsis of these findings strongly suggests αvβ3 integrins to be involved in WNV entry into target cells. However, results provide evidence that integrins are not the exclusive receptor for WNV, which is in accordance with the multiple receptors concept established in the literature for other Flavivirus members. Other receptors and associated pathways are used (i) alternatively or (ii) in addition. The results have important implications for further research on cellular factors that are crucial for WNV entry and thereby determine the basic mechanisms of infection. This knowledge would contribute to an improved understanding of WNV pathogenesis and of the susceptibility of cells in order to allow the control of this public health threat, and the prevention and treatment at the level of individuals, humans and animals, by the development of anti-viral drugs targeting the virus entry.

Das West-Nil-Virus (WNV) könnte unter den sich verändernden Umwelt- und Klimabedingungen und in Folge des zunehmenden weltweiten Reiseverkehrs und Handels eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheitsvorsorge darstellen. Das Virus wurde 1937 aus dem Blut einer fiebernden Frau in der West-Nil Region Ugandas isoliert, erhielt aber erst weltweite Aufmerksamkeit, nachdem es 1999 in die USA eingeschleppt worden war, und sich innerhalb von drei Jahren über den nordamerikanischen Kontinent verbreitet hatte. Seitdem werden in den USA jährlich mehrere hundert Menschen und Pferde mit WNV infiziert, – vielfach mit tödlichem Ausgang. In den letzten Jahren wurde eine zunehmende Anzahl von WNV-Ausbrüchen auch in Europa gemeldet. Um dieser Bedrohung mit Präventions-, Bekämpfungs- und Behandlungs-Strategien begegnen zu können, ist das Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Infektion von Wirtszellen von großer Bedeutung, weil diese wesentlich die Übertragung und Pathogenese von WNV, sowie die spezifische Empfänglichkeit verschiedener Wirtsspezies beeinflussen. Zu diesem Zweck ist die Identifizierung von Rezeptoren und von mit diesen assoziierten Molekülen unabdingbar, da sie den Eintritt von WNV in die Zelle vermitteln bzw. daran beteiligt sind. Die ersten Interaktionen mit der Wirtszelle bestimmen nicht nur die Empfänglichkeit der Zelle gegenüber dem Virus, sondern sie tragen möglicherweise auch zum außergewöhnlich breiten Wirtstropismus von WNV bei. Das Integrin αvb3 soll der älteren Literatur zufolge für WNV als zellulärer Rezeptor dienen; allerdings wurde kürzlich eine Beteiligung am Eintritt des Virus in die Zelle bezweifelt. Diese wissenschaftliche Kontroverse bildet die Grundlage für die vorliegende Studie. Ziel ist es zu klären, ob Integrine am Viruseintritt beteiligt sind. Dies schließt weitere Fragestellungen hinsichtlich ihrer Funktion, der relativen Bedeutung ihrer Beteiligung am Eintritt und mögliche Unterschiede in der Bindungs- und Endozytoseeffizienz von verschiedenen Virusstämmen ein. Um die Empfänglichkeit spezifisch Integrin-defizienter Zellen für WNV zu untersuchen, wurde ein Zellkulturmodell etabliert, das auf Mausfibroblastenzellen beruht. Wildtyp, αv-Integrin-defiziente, β3-Integrin-defiziente und αvβ3-Integrin-Doppelknock-out Fibroblasten wurden aus 12,5 Tage alten Mausembryonen mit einer Modifikation der genomischen Sequenz der entsprechenden Integrin-Untereinheit isoliert. Die Zellen wurden in Kultur gebracht und hinsichtlich ihrer Expressionsmuster mit Immunfluoreszenzfärbung und bezüglich der Expressionshöhe mithilfe von Durchflusszytometrie charakterisiert. Außerdem wurden β1-Integrin-defiziente Mausnierenfibroblasten und ihre Mutterzelllinie in die Untersuchungen einbezogen. Die Wildtypzellen und Integrin-defizienten Zelllinien wurde in einem parallelen Ansatz mit jeweils einem der vier WNV-Stämme New York 1999, Dakar, Uganda und Sarafend infiziert. Um die Effizienz der Bindung und der Internalisierung anhand der Virusausbeute zu bestimmen, wurde mittels qRT-PCR die Anzahl der Viruspartikel gemessen. Außerdem wurde die Beteiligung von zellmembran-gebundenem Heparansulfat als Faktor für die Anheftung der Viren an die Zelloberfläche untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei Zelltypen, Lcells (Maus-Bindegewebszellen) und CHO-K1 Zellen (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters), und ihre Glykosaminoglykan- oder Heparansulfat-defizienten Abkömmlinge infiziert, um die Bindungs- und Replikationseffizienzen vergleichen zu können. Die wesentlichen Schlussfolgerungen aus den Versuchen sind Folgende: (i) Das Vorhandensein von αv-, b1- oder b3-Integrinen auf der Oberfläche von Zellen ist keine Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion der Mausfibroblastenzellen mit WNV. Alle vier WNV-Stämme konnten sich in den Integrin-defizienten Zellen vermehren. Allerdings war die Replikationseffizienz in den β3-Integrin-defizienten Zellen deutlich geringer als in den Wildtypzellen. Aus diesem Grund wurden β3-Integrin-defiziente embryonale Mausfibroblasten mit einem Expressions-Plasmid transfiziert, das die β3-Integrin-Untereinheit enthielt (‚Rescuezellen’; in Unterpunkt ii und iii behandelt). (ii) Die ursprüngliche Annahme, dass Integrine als Rezeptoren fungieren, die sowohl die Virusbindung als auch Virusaufnahme in einem einzigen Schritt vermitteln, wird verworfen. Die Bindungseffizienz an die Zelloberfläche Integrin-defizienter Zellen war vergleichbar mit der von Integrin-exprimierenden Zellen. Antikörper, die die b1- oder b3-Integrin-Untereinheit blockieren, waren nicht in der Lage, die Virusbindung an β1- oder β3-Integrin-exprimierende Zellen zu beeinträchtigten, und hatten keine Auswirkung auf den Erfolg der Infektion. (iii) Die Expression von Integrinen wirkt sich positiv auf die Virusausbeute aus, wie sie im Vergleich von β3-Integrin-Rescuezellen und β1-Integrin-exprimierenden (flox) Zellen zu den entsprechenden Integrin-defizienten Zellen deutlich wurde. In welcher Phase sich Integrine in den Viruseintritt in die Zelle oder in nachfolgende Abläufe einschalten, ist bisher unklar. Aufgrund der Oberflächenlokalisation von Integrinen wird eine Funktion auf der Ebene der Virusinternalisierung nahe gelegt, entweder indem sie die Endozytose vermitteln oder indem sie mit anderen bisher nicht identifizierten Oberflächenrezeptoren in Form von Aktivierung oder Inhibierung interagieren, oder indem sie diese Proteine so verändern, dass eine verbesserten Zugänglichkeit für das Virus erreicht wird. (iv) Unterschiede zwischen den vier WNV-Stämmen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, wirken sich nicht auf die funktionelle Beteiligung von β1- und β3- Integrinen während des Viruseintritts und/oder der Virusreplikation aus. (v) Die Wiederherstellung (Rescue) der β3-Integrin-Untereinheit in CHO-K1 Zellen und die konstitutive Expression von αvβ3-Integrinen in den stabil transfizierten Zellen führt nicht zur Permissivität für WNV. Deshalb wird angenommen, dass ein anderes Oberflächenprotein die Internalisierung ermöglicht, entweder im Zusammenwirken mit oder unabhängig von αvβ3-Integrinen. Außerdem unterscheidet sich die Effizienz der Bindung an die Zelloberflächen der CHO-K1-Zellen nicht wesentlich von der anderer Zellen. In Übereinstimmung mit anderen Ergebnissen dieser Arbeit (siehe Unterpunkt ii) deutet dies darauf hin, dass αvb3-Integrine weder die Bindung von WNV an die Zelloberfläche noch die Virusaufnahme in die Zelle in einem eigenständigen, von anderen Faktoren unabhängigen Prozess bewirken. (vi) Heparansulfat kommt als Faktor für die Anheftung von WNV an Zelloberflächen in Frage; allerdings kann nur ein begrenzter Anteil aller gebundenen Viruspartikel dadurch erklärt werden. Die Zusammenfassung dieser Ergebnisse weist deutlich auf eine Beteiligung von αvβ3-Integrinen am WNV-Eintritt in Wirtszellen hin. Andererseits zeigen die Ergebnisse, dass die hier untersuchten Integrine nicht die einzigen Rezeptoren für WNV sind, sondern dass weitere Zelloberflächenproteine am Eintritt beteiligt sind, wie dies in der Literatur für andere Flavivirus Spezies beschrieben wurde. Andere Rezeptoren und rezeptorabhängige Wege werden entweder (i) alternativ oder (ii) zusätzlich zu αvβ3-Integrinen für die Infektion von Zellen benutzt. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Ansatzpunkte für die weitere Forschung, wenn es darum geht, die zellulären Faktoren zu identifizieren, die entscheidend für den Eintritt von WNV sind, womit auch zum besseren Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Virusinfektion beigetragen wäre. Dieses Wissen würde zweifellos zu einem tieferen Verständnis der WNV-Pathogenese und der unterschiedlichen Empfänglichkeit von Wirtszellen beitragen. Damit würde es möglich, in der öffentlichen Gesundheitsvorsorge geeignete Gegenstrategien zu entwickeln, und durch die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente die Vorbeugung und Behandlung auf der Ebene individueller Erkrankungen bei Mensch und Tier zu verbessern.

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Schmidt, Katja: Cellular factors modulating the entry efficiency of West Nile virus. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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