Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung des Membranpotentials von glatten Muskelzellen der Labmagenmuskulatur und dessen Beeinflussung durch Ketonkörper, Kalzium und Kalium

Zurr, Lisa

The left displacement of the abomasum (LDA) is a common disease in high yielding dairy herds, its pathogenesis has not yet been finally determined. The ketone body beta-hydroxybutyrate (BHB) is regarded as a sensitive factor for an LDA risk. Additionally, hypokalemias and hypocalcemias are observed in LDA cows. Causal relationships have, however, not been established. Aim of the present study was to contribute to the understanding of the pathogenesis of LDA. This was done by characterizing the membrane potential and the slow waves in abomasal smooth muscle cells by microelectrode technique and by determining possible effects of BHB and of different calcium and potassium concentrations on the membrane potential. The next step was to combine the microelectrode results with in vitro motility experiments of abomasal smooth muscles. Strips of the circular smooth muscles of the abomasum were prepared for the microelectrode technique and for in vitro motility measurements. For the microelectrode measurements 23 bulls (beef bred) were sampled. The time control parameters were measured in buffer solution with a total calcium concentration of 1.2 mmol/l CaCl2 and with a total calcium concentration of 2.4 mmol/l CaCl2. Additionally a treatment with 5 mmol/l BHB was tested under low- and normal-calcium conditions and the effect of barium chloride (2 mmol/l) was checked under low-calcium conditions. Tissue samples from 13 wethers were incubated in buffer solution with 1.2 mmol/l CaCl2 and measured under control, BHB and barium chloride conditions. Goats were divided into 2 groups: the control group (4 goats) was fed a Ca-balanced diet and their tissue samples were measured in buffer solution with 2.4 mmol/l CaCl2. The second group was fed a low-calcium diet (5 goats) and their samples were incubated in buffer solution with 1.2 mmol/l CaCl2. Both groups were treated with 5 mmol/l BHB. The last group of ruminants were dairy cows with LDA. These cows were sampled during a laparotomy with omentopexy. Their muscle samples were incubated in buffer solution with 1.2 mmol/l CaCl2 and treated with 5 mmol/l BHB. Parameters determined during the measurements of membrane potentials were the basal membrane potential (mV), the frequency of depolarisations (1/min) and the height of the slow waves amplitudes ≥ 3mV and ≥ 5mV. Ten bulls were sampled additionally for the in vitro motility tests. These tissues were incubated in buffer solution with 1.2 mmol/l CaCl2 and treated with 5 mmol/l BHB or an equimolar NaCl-solution that served as control treatment. Subsequently, the addition of 1.2 mmol/l CaCl2 doubled the calcium concentration to 2.4 mmol/l CaCl2 in the presence or absence of BHB. In parallel experiments the potassium concentrations in the buffer solution was changed from 5.4 mmol/l KCl to 2 mmol/l KCl and then back to 3 mmol/l KCl. Contractile activity was determined by measuring the average amplitude of contraction (mN), the frequency of contractions (1/min), the average force of the contraction (mN) and the activity of contraction (mN/min). The microelectrode measurements showed a wide range of variation in the frequency of the slow waves and height of amplitudes of the membrane potential changes. The subdivision into amplitudes ≥ 3 mV and ≥ 5 mV was an attempt to differentiate the contraction promoting slow waves from an ubiquitous background noise. It became clear, in comparison with other authors and with the results of the motility tests that the frequency of the slow waves with amplitudes ≥ 5 mV laid in the same order as the frequency of contractions. Because of the reproducibility of the membrane potential measurements and the comparability with the activity of motility, the microelectrode technique can be used as adequate method to define the slow waves in the abomasum. The addition of barium chloride induced a depolarisation of the basal membrane potential in all animal groups without affecting the frequency or the height of the slow waves. Barium thus imitates hyperkalemic conditions, which result in less negative membrane potentials as well. Thereby the threshold potential of potential-dependent calcium channels could be reached faster and longer, which would result in a longer and stronger contraction of the smooth muscle cell. This theory could be confirmed in different studies and is also supported by the in vitro motility measurements with different potassium concentrations in our study. The reduction of the potassium concentrations from 5.4 mmol/l to 2 mmol/l resulted in a nominal decrease in the activity of contractions. The subsequent addition of 1 mmol/l KCl to a total of 3 mmol/l KCl induced a nominal increase in contraction activity. An influence of BHB could not be shown in all groups of ruminants. In wethers BHB had a negative effect on the frequency of slow waves with amplitudes ≥ 3 mV. In goats fed the low-calcium diet BHB obviously reduced the frequency of the slow waves with amplitudes ≥ 5 mV. But this effect was not significant, on the basis of the small sample size and the wide range of variation. The in vitro motility tests demonstrated no BHB effects as well, independent of the calcium content in buffer. The changes in the calcium concentration had neither influences on the slow waves nor on the motility of the abomasal smooth muscles. In this regard, it is to consider that a calcium concentration of 1.2 mmol/l (0.91 mmol/l Caionized) represents only a subclinical hypocalcemia in vivo. Different works have shown that only very low calcium concentrations are able to reduce the motility of smooth muscles. A slightly hypocalcemia alone seems not to be able to cause depressed abomasal motility. In conclusion, the theory of a multifactorial pathogenesis of the LDA is supported by this study. No single causing factor could be determined. Though, combinations of high BHB and low calcium and potassium concentrations negatively influenced slow wave activity or the contractility of abomasal smooth muscle tissue. It is thus appropriate to carry out a calcium and ketosis prophylaxis before parturation in dairy cows and to keep their feed intake on a constant level.

Die Labmagenverlagerung (LMV) des Rindes ist eine weit verbreitete Erkrankung des Gastrointestinaltraktes in hochleistenden Milchviehbeständen, deren Pathogenese nicht abschließend geklärt ist. Ketosen, Hypokalzämien und Hypokaliämien sind dabei oft mit einer verminderten Labmagenmotilität vergesellschaftet, ohne dass man mögliche kausale Zusammenhänge benennen kann. Ziel dieser Arbeit war es einen Beitrag zur Aufklärung der Pathogenese der LMV zu liefern. Dazu sollten zunächst die Schwankungen im Membranpotential, sog. Slow waves, mittels Mikroelektrodentechnik als Grundlage der Kontraktion glatter Muskelzellen im Labmagen verschiedener Wiederkäuer charakterisiert werden, um im weiteren Verlauf der Arbeit eine mögliche Beeinflussung der Slow waves durch verschiedene Kalziumkonzentrationen, β-Hydroxybutyrat (BHB) als Ketonkörper und Barium als Kaliumkanalblocker zu untersuchen. Im letzten Teil wurden die Ergebnisse der intrazellulären Aufnahmen auch auf der Ebene der Kontraktionsaktivität mittels in vitro Motilitätsmessungen überprüft. Für die Mikroelektrodenmessungen wie auch für die in vitro Motilitätsmessungen wurden Muskelproben der zirkulären Muskelschicht der Labmagenwand präpariert und in Pufferlösungen inkubiert. Für die Mikroelektrodenmessungen wurden insgesamt 23 Mastbullen beprobt. Dabei wurde der Zeitverlauf der Membranpotentialschwankungen in Lösungen mit 1,2 mmol/l CaCl2 sowie mit 2,4 mmol/l CaCl2 gemessen. Zusätzlich wurde die Wirkung von 5 mmol/l BHB (unter hypo- und normokalzämischen Bedingungen) und 2 mmol/l Bariumchlorid (unter hypokalzämischen Bedingungen) getestet. Die Proben der insgesamt 13 Schlachthammel wurden nur in Pufferlösungen mit 1,2 mmol/l CaCl2 im Zeitverlauf, unter 5 mmol/l BHB-Einfluss und mit 2 mmol/l Bariumchlorid gemessen. Auch von Ziegen lagen Proben der Labmagenwand vor. Diese waren in zwei Gruppen unterteilt: 4 Ziegen waren unter normokalzämischen Bedingungen gefüttert worden und galten als Kontrollgruppe, die nur mit Pufferlösung und 2,4 mmol/l CaCl2 gemessen wurden, während die zweite Gruppe, 5 Ziegen, einer restriktiven Kalziumversorgung ausgesetzt war und in den Mikroelektrodenmessungen mit 1,2 mmol/l CaCl2 gemessen wurde. Beide Gruppen wurden wieder mit 5 mmol/l BHB behandelt. Letztlich wurden noch 5 an LMV erkrankte Kühe während einer stehend durchgeführten Laparotomie von rechts mit rechtsseitiger Omentopexie beprobt. Diese wurden ebenfalls mit Pufferlösung mit 1,2 mmol/l CaCl2 und 5 mmol/l BHB inkubiert. In den Mikroelektrodenmessungen wurden folgende Parameter ausgewertet: das basale Membranpotential [mV], die Frequenz der Slow waves mit Amplituden ≥ 3 mV [1/Min], die Höhe der Amplituden ≥ 3 mV [mV], die Frequenz der Amplituden ≥ 5 mV [1/Min] sowie die Höhe der Amplituden ≥ 5 mV [mV]. Für die in vitro Motilitätsmessungen wurden ausschließlich Proben von Mastbullen genommen. Bei allen 10 beprobten Tieren wurde 5 mmol/l BHB als Behandlung zugegeben, als Kontrolle diente eine equimolare Kochsalzlösung. Es lag eine Kalziumkonzentration von 1,2 mmol/l vor. Im weiteren Verlauf folgte eine Verdopplung des Kalziumgehaltes in der Pufferlösung auf 2,4 mmol/l. In parallelen Versuchen wurde die Kaliumkonzentration im Puffer von ursprünglich 5,4 mmol/l KCl auf 2 mmol/l KCl abgesenkt und anschließend wieder auf 3 mmol/l KCl erhöht. Als Motilitätsparameter dienten die Kontraktionsfrequenz [1/Min], die mittlere Kontraktionsamplitude [mN], die aktive Kontraktionskraft [mN] und die Kontraktionsaktivität [mN/Min]. Die im Rahmen der Mikroelektrodenmessungen vorgenommene Charakterisierung der Membranpotentialschwankungen zeigte eine große Schwankungsbreite der Amplitudenhöhe und Frequenz. Die vorgenommene Unterteilung der Slow waves in Amplituden ≥ 3 mV und ≥ 5 mV war der Versuch einer Abgrenzung von einem allgegenwärtigen „Grundrauschen“ des Membranpotentials zu tatsächlichen, eventuell kontraktionsauslösenden Slow waves. Dabei zeigte sich beim Studium weiterer Literatur und Vergleichen zu den eigenen Motilitätsmessungen sowie denen anderer Autoren, dass die Frequenz der Amplituden ≥ 5 mV im Bereich der Frequenz der Kontraktionen lag. Die Vergleichbarkeit der vorliegenden Ergebnisse aus den Mikroelektrodenergebnissen zu den Daten aus der Literatur sowie deren Reproduzierbarkeit führen zu dem Schluss, dass die Mikroelektrodenmessung als adäquate Methode zur Darstellung von Slow waves in der glatten Muskulatur des Labmagens genutzt werden kann. Unter dem Einfluss von Barium kam es bei den behandelten Präparaten zu einer reversiblen signifikanten Depolarisation des basalen Membranpotentials ohne Einfluss auf die Frequenz und Höhe der Amplituden. Damit imitiert Barium hyperkaliämische Bedingungen, unter denen es ebenfalls zu weniger negativen Werten beim Membranpotential kommt. Dadurch könnte das Schwellenpotential spannungsabhängiger Kalziumkanäle schneller und länger erreicht sein, was zu einer stärkeren Kontraktion führen würde. Diese Theorie wurde in verschiedenen Motilitätsstudien glatter Muskelzellen unter unterschiedlichen Kaliumkonzentrationen schon bestätigt. Auch die eigenen in vitro Motilitätsstudien gaben Hinweise für die Beeinflussung der Kontraktionsaktivität durch veränderte Kaliumgehalte. So kam es bei Absenkung des Kaliumgehaltes im Puffer von 5,4 mmol/l KCl auf 2 mmol/l KCl zu einem nominellen Abfall der Kontraktionsaktivität. Mit Erhöhung auf 3 mmol/l KCl zeigte sich wieder ein leichter Anstieg. Ein deutlicher Einfluss von BHB auf die ausgewerteten Parameter war nicht bei allen beprobten Wiederkäuern direkt festzustellen. Bei den Hammeln hatte BHB einen signifikanten negativen Effekt auf die Frequenz der Amplituden ≥ 3 mV. Die Ca-restriktiv versorgten Ziegen mit geringgradiger subklinischer Hypokalzämie zeigten einen deutlichen Abfall der Frequenz der Amplituden ≥ 5 mV unter BHB-Behandlung, welcher allerdings aufgrund der großen Streuung bei geringer Stichprobengröße nicht signifikant war. Auch bei den in vitro Motilitätsmessungen ergaben sich unabhängig vom Kalziumgehalt im Puffer keine Veränderungen durch die BHB-Behandlung. Die Veränderungen im Kalziumgehalt zeigten weder Auswirkungen auf die Slow waves, noch auf die Motilität. Es ist zu bedenken, dass ein Kalziumgehalt von 1,2 mmol/l (0.91 mmol/l Caionisiert) nur leicht im subklinischen hypokalzämischen Bereich liegt. Schon frühere Publikationen konnten zeigen, dass nur deutlich abgesenkte Kalziumkonzentrationen negative Effekte auf die Motilität der glatten Muskulatur haben. Es lässt sich also festhalten, dass die geringgradige Hypokalzämie, in der sich sehr viele hochtragende Milchkühe um den Geburtszeitpunkt befinden, nicht der alleinige Auslöser für die Hypomotilität der Labmagenmuskulatur sein kann. Zusammenfassend kann die Theorie der multifaktoriellen Pathogenese der Labmagenverlagerung beim Rind von dieser Arbeit unterstützt werden. Es wurde kein alleiniger kausaler Faktor aus den untersuchten Einflussfaktoren identifiziert, während sich Kombinationen hoher BHB- sowie niedriger Kalzium- und Kaliumkonzentrationen negativ auf die Frequenz der Slow waves oder die Kontraktilität der Labmagenmuskulatur auswirkten. Es empfiehlt sich daher vor der Geburt eine Kalzium-Prophylaxe beim Muttertier durchzuführen, ebenso die Futteraufnahme möglichst konstant zu halten und eine Mastkondition zur Ketose-Prophylaxe zu vermeiden.

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Zurr, Lisa: Untersuchung des Membranpotentials von glatten Muskelzellen der Labmagenmuskulatur und dessen Beeinflussung durch Ketonkörper, Kalzium und Kalium. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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