Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus

Koo, Nadia Femina

The aim of this study was to understand the structural development of the primitive node of the mouse, as well as to describe the molecular formation of the highly polarized primitive node cells in detail. According to current knowledge, the structure and function of the primitive node in the mouse are important for the breaking event of the bilateral symmetry during the left-right axis development, which accounts for one of the main steps in the establishment of the left-right body axis. Contemporary literature provides only few insights into development and exact structure of the primitive node. Since different methods have been used for the analyses, it has been possible to demonstrate the development of the early primitive node. Samples have been analysed by immunohistochemical and electron microscopy. In-situ-hybridization has been performed, semi thin sections were investigated and videos of the node cilia’s motility have been shot. As samples, routinely E7.5 to 8.0 embryos from CD1-Wildtype mice where utilized. With regard to immunohistochemical studies, characteristic marker proteins of cell polarity have been used. Concerning the development of the node, this study confirms that the primitive node does not only have one single origin, but developd from different clusters of cells, which thereafter fuse and form the final characteristic horseshoe structure. With the help of electron microscopic analysis of the cilia an increase in cilia length of the node has been demonstrated. This is almost linear to the increasing age of the wildtype-embryo. The motility of the cilia and the direction of the fluid flow over the node have been analysed by video microscopy. These results correspond to data which have already been published. Immunohistochemical results: Additional monocilia exist outside the primitive node in surrounding tissues, the function of which remains elusive is confirmed. The expression of Claudin 4 is verified, while Claudin 5 is expressed for the first time in early embryonic development and in the primitive node. The JAM-A - expression is confirmed in epithelial cells of the embryo. It could be shown that it is associated with node cilia. Zo-1 is detected in the endoderm, ectoderm, as well as in the mesoderm, which was expected from literature. β-Catenin is not only localized within the cell-cell-contact and in the apical cell junctions, but is also found to be asymmetrically distributed to the left side of the embryo with a peak expression in somite stage 0, followed by a progressive decrease in asymmetrical expression with increasing age of the embryo. E-Cadherin is localized in epithelial cells, but for the first time a higher concentration is noticed in the primitive node. N-Cadherin, so far only known to be located in the neural epithelium and the neural plate, is also identified in the nodal pit, in endodermal tissue and especially in ectodermal tissue. By means of immunohistochemical analyses it could be asserted that Annexin 2 is expressed in the node and Annexin 6 is expressed in the node and the endoderm. Despite only minimal expression of Smad 1 and 2 in the node, a high accumulation of Smad 3 in the node could be observed. So far, Smad 1-3 could only be detected by In-situ-hybridization studies. An asymmetric distribution of p-Pax, Smad 1, Nkd1 (by In-situ-hybridization) and p-Tyr in favour of the left side of the embryo is found and has not been presented in the literature so far. Concerning the Pkd2 mutant embryos the following differences compared to wildtype-embryos have been observed: Monocilia in Pkd2 mutant embryos are slightly longer and show an abnormal growth in length. However, a comparable motility and directional fluid flow by node cilia over the node in Pkd2 mutants and wildtype-embryos has been found, which confirms the literature. The difference in length either results from a disturbance in the anterograde or retrograde transport of molecules, which is essential for cilia growth and maintenance, or an abnormal signal transduction mechanism, which is related to terminal differentiation and polarization of epithelial cell layers. Contrary to literature, the localization of JAM-A turns out more diffuse than expected and additionally presents itself in the mesoderm. This may indicate a pathological disturbance of the TJ complex and related proteins. β-Catenin shows a generally stronger and more diffuse distribution and is not limited to the apical portion of the cell body, which accounts at least for an abnormal assembly of Adherens Junctions in Pkd2 mutant embryos. The fact that β-Catenin is expressed stronger points out the likewise stronger expression of Pkd-2-mutant renal epithelial cells. Furthermore we could show for the first time that the distribution of E-Cadherin is different as well, which additionally supports evidence for a disturbed Adherens Junction assembly. With the data generated in this study regarding the development of the primitive node, including cell-cell-contacts and cell-matrix-contacts, it has been managed to establish a solid basis for further studies of the normal and pathological development of structural features of the node. Knowledge on the default state of embryonic development, molecular mechanisms of abnormal or disturbed axial development can be assessed and understood at an early stage. Using the example of Pkd2 mutant embryos, this study demonstrates that it is possible to detect abnormal node development, and hence provide hints for pathological processes and dysregulated signal transductions

Ziel dieser Arbeit ist es zum einen die strukturelle Entwicklung des Primitivknotens nachzuvollziehen und zum anderen den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen zu beschreiben. Nach derzeitigem Wissensstand ist die Struktur und Funktion des Primitivknotens bei der Maus ausschlaggebend für den Bruch der bilateralen Symmetrie während der Links-Rechts-Achsenentwicklung, der zu einem der wichtigsten Schritte in der Körperachsenentwicklung zählt. Über die Entwicklung und den exakten Aufbau des Primitivknotens ist bislang jedoch noch sehr wenig bekannt. Zur Darstellung der frühembryonalen Entwicklung des Primitivknotens erfolgten die Analysen mittels verschiedener Methoden. Hierzu wurden immunhistochemische und elektronenmikroskopische Analysen sowie In-situ-Hybridisierungen durchgeführt, Semidünnschnitte hergestellt und Videoaufnahmen von Primitivknotenzilien erstellt. Das Untersuchungsmaterial hierfür bestand aus E7.5 bis E8.0 Embryonen von CD1-Wildtyp Mäusen. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden charakteristische Zellpolaritätsmarker verwendet. Bezüglich der Entwicklung des Primitivknotens konnte bestätigt werden, dass der Primitivknoten nicht aus einem Ursprung entsteht, sondern aus verschiedenen Zellklustern hervorgeht, die danach miteinander „verschmelzen“ und den typischen hufeisenförmigen Primitivknoten bilden. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen der Zilienlängen wurde ein mit steigendem Alter bei den Wildtypembryonen annähernd linear verlaufendes Zilienwachstum festgestellt. Die mittels Videomikroskopie erstellten Ergebnisse über die von mir nachgewiesene Zilienmotilität und Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten bei Wildtypembryonen entsprechen der bekannten Literatur. Immunhistochemische Ergebnisse: 1.      Dass Monozilien außerhalb des Primitivknotens vorhanden sind, deren Funktion derzeit völlig unbekannt ist, ist bestätigt worden. 2.      Die Expression von Claudin 4 ist ebenfalls verifiziert, während Claudin 5 im frühen Embryo und im Primitivknoten erstmalig detektiert ist. 3.      Ebenfalls ist die JAM-A-Expression in epithelialen Zellen des Embryos bestätigt. Neue Erkenntnisse der Assoziierung der JAM-A-Epression im Primitivknoten mit Zilien konnten aufgezeigt werden. 4.      Die Detektion von ZO-1 sowohl in Entoderm, Ektoderm als auch im Mesoderm stimmt mit der Literatur überein. 5.      β-Catenin ist nicht nur in den Zell-Zell-Kontakten und hier in der apikalen Hälfte der Zellen lokalisiert worden, sondern zusätzlich zeigte sich erstmalig, dass β-Catenin ein asymmetrisches Verteilungsmuster zugunsten der linken Seite des Embryos aufweist, das im 0-Somitenstadium am stärksten ausgeprägt ist und mit zunehmendem Alter des Embryos relativiert wird. 6.      E-Cadherin ist in epithelialen Zellen lokalisiert und zum ersten Mal konnte E-Cadherin jedoch verstärkt im Primitivknoten lokalisiert werden. 7.      N-Cadherin, das bislang nur im Neuroepithel und der Neuralplatte entdeckt worden ist, ist nun in der Primitivknotengrube, im Ento- und verstärkt im Ektoderm lokalisiert worden. 8.      Mit Hilfe von immunhistochemischen Analysen ist erstmalig Annexin 2 im Primitivknoten und Annexin 6 im Primitivknoten und Entoderm nachgewiesen worden. 9.      Smad 1 und 2 im Primitivknoten ist selbst nur gering exprimiert, während Smad 3 im Primitivknoten akkumuliert zu finden ist. Bislang wurde Smad 1-3 nur in In-situ-Hybridisierungsstudien nachgewiesen. 10.   Die asymmetrischen Verteilung zugunsten der linken Seite von p-Pax, Smad 1, Nkd1 (Nkd1 mittels In-situ-Hybridisierung nachgewiesen) und p-Tyr konnte erstmalig aufgezeigt werden. Bei Pkd2 mutanten Embryonen konnten im Vergleich zu Wildtypembryonen folgende Unterschiede festgestellt werden: 1.      Die Monozilien bei Pkd2 mutanten Embryonen sind geringfügig länger und zeigen ein unregelmäßiges Längenwachstum. Die Motilität und die Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten sind jedoch vergleichbar und konnten mit den Literaturergebnissen bestätigt werden. Die Unterschiede im Längenwachstum der Zilien könnten durch Störungen des anterograden oder retrograden Transports von Molekülen innerhalb der Zilie oder durch Störung von Signalmechanismen, die die terminale Differenzierung der Epithelzellen anzeigen, verursacht werden. 2.      Neu entdeckt ist die Lokalisation von JAM-A, die diffuser und auch im Mesoderm auftritt, was auf eine pathologische Veränderung der Tight Junctions und der beteiligten Proteine schließen lässt. 3.      β-Catenin zeigt ein stärkeres und schwammigeres Verteilungsmuster und die Lokalisation von β-Catenin ist nicht auf die apikale Hälfte der Zellen beschränkt, so dass zumindest der Aufbau der Adherens Junctions bei Pkd2 mutanten Embryonen gestört ist. Die Tatsache, dass β-Catenin eine stärkere Expression aufzeigt, unterschreibt die ebenfalls stärkere Expression bei Pkd2 mutanten Nierenepithelzellen. 4.      Erstmals konnte aufgezeigt werden, dass E-Cadherin Unterschiede in der Verteilung aufzeigt, was zusätzlich auf eine Störung des Aufbaus der Adherens Junctions hinweist. Mit den in dieser Arbeit generierten Daten zur Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte konnte eine solide Grundlage für weiterführende Studien zur normalen und pathologischen Entwicklung, der strukturellen Beschaffenheit und Funktion des Primitivknotens geschaffen werden. Nur in Kenntnis des Normalzustands können die mole-kularbiologischen Mechanismen normaler und fehlerhafter Körperachsenentwicklung frühzeitig erkannt und verstanden werden. Am Beispiel von Pkd2 mutanten Embryonen wurde schließlich gezeigt, dass Unterschiede zu detektieren sind und Hinweise auf pathologische Prozesse und dysregulierte Signaltransduktionswege geben können.

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Koo, Nadia Femina: Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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