Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus

Ziel dieser Arbeit ist es zum einen die strukturelle Entwicklung des Primitivknotens nachzuvollziehen und zum anderen den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen zu beschreiben. Nach derzeitigem Wissensstand ist die Struktur und Funktion des Primitivknotens bei der Maus ausschlaggebend für den Bruch der bilateralen Symmetrie während der Links-Rechts-Achsenentwicklung, der zu einem der wichtigsten Schritte in der Körperachsenentwicklung zählt. Über die Entwicklung und den exakten Aufbau des Primitivknotens ist bislang jedoch noch sehr wenig bekannt. Zur Darstellung der frühembryonalen Entwicklung des Primitivknotens erfolgten die Analysen mittels verschiedener Methoden. Hierzu wurden immunhistochemische und elektronenmikroskopische Analysen sowie In-situ-Hybridisierungen durchgeführt, Semidünnschnitte hergestellt und Videoaufnahmen von Primitivknotenzilien erstellt. Das Untersuchungsmaterial hierfür bestand aus E7.5 bis E8.0 Embryonen von CD1-Wildtyp Mäusen. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden charakteristische Zellpolaritätsmarker verwendet. Bezüglich der Entwicklung des Primitivknotens konnte bestätigt werden, dass der Primitivknoten nicht aus einem Ursprung entsteht, sondern aus verschiedenen Zellklustern hervorgeht, die danach miteinander „verschmelzen“ und den typischen hufeisenförmigen Primitivknoten bilden. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen der Zilienlängen wurde ein mit steigendem Alter bei den Wildtypembryonen annähernd linear verlaufendes Zilienwachstum festgestellt. Die mittels Videomikroskopie erstellten Ergebnisse über die von mir nachgewiesene Zilienmotilität und Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten bei Wildtypembryonen entsprechen der bekannten Literatur. Immunhistochemische Ergebnisse: 1.      Dass Monozilien außerhalb des Primitivknotens vorhanden sind, deren Funktion derzeit völlig unbekannt ist, ist bestätigt worden. 2.      Die Expression von Claudin 4 ist ebenfalls verifiziert, während Claudin 5 im frühen Embryo und im Primitivknoten erstmalig detektiert ist. 3.      Ebenfalls ist die JAM-A-Expression in epithelialen Zellen des Embryos bestätigt. Neue Erkenntnisse der Assoziierung der JAM-A-Epression im Primitivknoten mit Zilien konnten aufgezeigt werden. 4.      Die Detektion von ZO-1 sowohl in Entoderm, Ektoderm als auch im Mesoderm stimmt mit der Literatur überein. 5.      β-Catenin ist nicht nur in den Zell-Zell-Kontakten und hier in der apikalen Hälfte der Zellen lokalisiert worden, sondern zusätzlich zeigte sich erstmalig, dass β-Catenin ein asymmetrisches Verteilungsmuster zugunsten der linken Seite des Embryos aufweist, das im 0-Somitenstadium am stärksten ausgeprägt ist und mit zunehmendem Alter des Embryos relativiert wird. 6.      E-Cadherin ist in epithelialen Zellen lokalisiert und zum ersten Mal konnte E-Cadherin jedoch verstärkt im Primitivknoten lokalisiert werden. 7.      N-Cadherin, das bislang nur im Neuroepithel und der Neuralplatte entdeckt worden ist, ist nun in der Primitivknotengrube, im Ento- und verstärkt im Ektoderm lokalisiert worden. 8.      Mit Hilfe von immunhistochemischen Analysen ist erstmalig Annexin 2 im Primitivknoten und Annexin 6 im Primitivknoten und Entoderm nachgewiesen worden. 9.      Smad 1 und 2 im Primitivknoten ist selbst nur gering exprimiert, während Smad 3 im Primitivknoten akkumuliert zu finden ist. Bislang wurde Smad 1-3 nur in In-situ-Hybridisierungsstudien nachgewiesen. 10.   Die asymmetrischen Verteilung zugunsten der linken Seite von p-Pax, Smad 1, Nkd1 (Nkd1 mittels In-situ-Hybridisierung nachgewiesen) und p-Tyr konnte erstmalig aufgezeigt werden. Bei Pkd2 mutanten Embryonen konnten im Vergleich zu Wildtypembryonen folgende Unterschiede festgestellt werden: 1.      Die Monozilien bei Pkd2 mutanten Embryonen sind geringfügig länger und zeigen ein unregelmäßiges Längenwachstum. Die Motilität und die Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten sind jedoch vergleichbar und konnten mit den Literaturergebnissen bestätigt werden. Die Unterschiede im Längenwachstum der Zilien könnten durch Störungen des anterograden oder retrograden Transports von Molekülen innerhalb der Zilie oder durch Störung von Signalmechanismen, die die terminale Differenzierung der Epithelzellen anzeigen, verursacht werden. 2.      Neu entdeckt ist die Lokalisation von JAM-A, die diffuser und auch im Mesoderm auftritt, was auf eine pathologische Veränderung der Tight Junctions und der beteiligten Proteine schließen lässt. 3.      β-Catenin zeigt ein stärkeres und schwammigeres Verteilungsmuster und die Lokalisation von β-Catenin ist nicht auf die apikale Hälfte der Zellen beschränkt, so dass zumindest der Aufbau der Adherens Junctions bei Pkd2 mutanten Embryonen gestört ist. Die Tatsache, dass β-Catenin eine stärkere Expression aufzeigt, unterschreibt die ebenfalls stärkere Expression bei Pkd2 mutanten Nierenepithelzellen. 4.      Erstmals konnte aufgezeigt werden, dass E-Cadherin Unterschiede in der Verteilung aufzeigt, was zusätzlich auf eine Störung des Aufbaus der Adherens Junctions hinweist. Mit den in dieser Arbeit generierten Daten zur Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte konnte eine solide Grundlage für weiterführende Studien zur normalen und pathologischen Entwicklung, der strukturellen Beschaffenheit und Funktion des Primitivknotens geschaffen werden. Nur in Kenntnis des Normalzustands können die mole-kularbiologischen Mechanismen normaler und fehlerhafter Körperachsenentwicklung frühzeitig erkannt und verstanden werden. Am Beispiel von Pkd2 mutanten Embryonen wurde schließlich gezeigt, dass Unterschiede zu detektieren sind und Hinweise auf pathologische Prozesse und dysregulierte Signaltransduktionswege geben können.