Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of haemophilia A and B in several dog breeds

Alcaraz Rodríguez, Patricia

The objective of this study was to identify the underlying genetic defect responsible for the haemophilic phenotype in different dogs.  Animals: The study included a Fila Brasileiro suffering from haemophilia B and three haemophilic A dogs: a Wire Haired Dachshund, a Great Dane, and a Poodle mix. The genetic study also included two related Wire-Haired Dachshund dogs, which were suspected to be carriers of haemophilia A, four related healthy Wire-Haired Dachshund dogs and further healthy control dogs. Materials and methods: DNA was isolated from EDTA blood from all these dogs. In the haemophilic Fila Brasileiro, the coding region and exon intron boundaries of the canine FIX gene were amplified and sequenced by using polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis. The obtained nucleotide sequences of the FIX gene were compared with the wild type canine FIX mRNA. Furthermore, intron sequences around exon 4 were also analysed. Genomic DNA from three healthy Fila Brasileiros was used to validate the results. In patients suffering from haemophilia A and related dogs, the coding region and exon intron boundaries of the canine FVIII gene were also analysed. The obtained nucleotide sequences were compared with the wild type canine FVIII mRNA. To confirm the results, specific exon screenings were carried out with new primer pairs. The results were validated with genomic DNA from ten random dog breeds and ten Great Danes. In addition, several protein structure modelling were carried out to evaluate the structural and functional relevance of the identified mutation in the Great Dane. Results: The failure of the amplification of exon 4 and intron sequences around it from genomic DNA of the haemophilic Fila Brasileiro and not from the control dog, as well as the correct amplification of exon 4 from genomic DNA of three normal Fila Brasileiros, revealed that a mutational event involving exon 4 and approximately 900 nucleotides upstream and at least 1000 nucleotides downstream of exon 4 is responsible for the haemophilic phenotype in this dog. Sequence analysis of the coding region and exon intron boundaries of the canine FVIII gene of a suspected carrier (dog 4) and five healthy Wire-haired Dachshunds (dogs 5-9) revealed five single nucleotide polymorphisms (SNPs): a c.141C>T in exon 1, a c.2782A>G, a c.2943G>A and a c.3608C>T in exon 14, and c.5292C>T in exon 15. Three of these SNPs (c.141C>T, c.2943G>A, and c.5292C>T) were synonymous polymorphisms and the two remaining nucleotide changes (c.2782A>G and c.3608C>T), which were also identified in exon 14 of some of ten random control dogs, were characterised as non-synonymous polymorphisms. Interestingly, sequence analysis of the canine FVIII gene of the haemophilic Wire-haired Dachshund did not reveal differences between the patient and the wild type canine FVIII cDNA, which suggested that the genetic defect responsible for haemophilia A in this dog is not located in the coding region and exon intron boundaries of the canine FVIII gene. Unfortunately, analysis of the FVIII gene of the second suspected carrier, which could have contributed to identifying the underlying defect of this dog family, was not possible due to the fact that the DNA sample was contaminated with human genomic DNA. The genetic defect which was responsible for haemophilia A in a Great Dane was identified as a c.6217T>C in exon 21 of canine FVIII gene, which leads to the replacement of tryptophan by arginine at amino acid position 2073 in the C1 domain of the canine FVIII protein. The relevance of this amino acid replacement is related to the great differences in charge, polarity and structure between these amino acids. This mutation was confirmed by the fact that screening of genomic DNA of ten healthy Great Danes did not show this missense mutation. In addition, elaborated protein models suggested that a possible active site is close to the altered amino acid, and confirmed a change in the structure of the truncated FVIII molecule. In contrast, no changes were observed in the FVIII molecule of healthy dogs.  Results of the elaborated genetic study in the Poodle mix demonstrated with sufficient clarity that a 40-46 bp insertion in exon 14 of canine FVIII gene was the causative mutation responsible for the haemophilic phenotype in this dog. The identified insertion contained a short sequence (TAAAG), followed by a poly-A tail (20-26 bp), and was flanked by a DNA duplication (15-bp). Analysis of the insertion revealed that a transcriptional frameshift and a premature stop codon “TAA” was located at the beginning of the insertion, c.3217-3219, which probably results in a 1072 amino acids translation product. This truncated protein would probably lack 59 % of amino acids of the B domain, as well as complete A3, C1 and C2 domains. In addition, four known SNPs were identified: c.141C>T in exon 1, c.2943G>A and c.3608C>T in exon 14, as well as c.5292C>T in exon 15. Conclusion: The results of the present study underline the fact that the molecular bases of canine haemophilia B and A are diverse in different breeds , which has also been confirmed in human haemophilia B and A. The development of specific genetic screening tests based on the identified mutations would enable the identification of possible carriers and receive valuable data on the incidence of the defect in the analysed breeds, which would be useful for the control of these hereditary disorders of haemostasis.

Das Ziel dieser Studie war die Identifizierung des Gendefektes, der verantwortlich für die Hämophilie bei verschiedenen Hunderassen ist.       Tiere: Die Studie umfasste einen Fila Brasileiro mit Hämophilie B und drei weitere Hunde mit Hämophilie A: einen Rauhhaardackel, eine Deutsche Dogge und einen Pudel-Mischling. Zwei verwandte Rauhhaardackel mit Verdacht auf Hämophilie A und vier verwandte gesunde Rauhhaardackel sowie weitere gesunde Kontrolltiere. Materialien und Methoden: Von allen diesen Hunden wurde die DNA aus EDTA-Blut isoliert. Im Falle des hämophilen Fila Brasileiro wurden die kodierende Region und Exon-Intron-Grenzen des caninen FIX-Gens mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Elektrophorese amplifiziert und sequenziert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen des FIX-Gens wurden mit dem Wildtyp der caninen FIX mRNA verglichen. Weiterhin wurden Intronsequenzen vor und nach dem Exon 4 analysiert. Es wurde genomische DNA von drei gesunden Fila Brasileiro verwendet, um die Ergebnisse zu validieren.       Bei Patienten mit Hämophilie A und verwandten Hunden wurden die kodierende Regionen und Exon-Intron-Grenzen des caninen FVIII Gens analysiert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit dem Wildtyp der caninen FVIII mRNA verglichen. Um die Ergebnisse zu bestätigen, wurden spezifische Exon-Screenings mit zusätzlichen Primerpaaren durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit genomischer DNA von zehn zufällig ausgewählten  Hunderassen und zehn Doggen validiert. Darüber hinaus wurden Protein-Struktur-Modellierungen durchgeführt, um die strukturelle und funktionelle Relevanz der identifizierten Mutation in Hunden der Rasse Great Dane zu überprüfen. Ergebnisse: Mittels PCR ließen sich Exon 4 und umgebende Intron-Sequenzen aus genomischer DNA der gesunden Fila Brasileiro erfolgreich amplifizieren. Die Amplifikation derselben Bereiche gelang nicht bei dem an Hämophilia B erkrankten Fila Brasileiro. Dies Ergebnis lässt darauf schließen, dass eine Mutation im Exon 4 sowie ungefähr 900 Nukleotide „upstream“ und mindestens 1000 Nukleotide „downstream“ von Exon 4 für die Hämophilie B in diesem Hund verantwortlich ist. Die Sequenzanalyse der kodierenden Regionen und Exon-Intron-Grenzen des caninen FVIII- Gens eines vermuteten Trägers der Hämophilie (Hund 4) sowie von fünf gesunden Rauhhaardackeln (Hunde 5–9) identifizierte fünf Einzel-Nukleotid-Polymorphismen („single nucleotide polymorphisms“, SNPs): c.141C>T, c.2782A>G, c.2943G>A, c.3608C>T und c.5292C>T. Drei SNPs (c.141C>T, c.2943G>A, und c.5292C>T) waren stumme Polymorphismen. Die anderen zwei Basenaustausche (c.2782A>G und c.3608C>T), die auch in Exon 14 von zehn zufällig ausgewählte Hunden identifiziert wurden, waren nicht-stumme Polymorphismen. Interessanterweise ergab die Sequenzanalyse des canine FVIII Gens des hämophilen Rauhhaardackels keinerlei Unterschiede im Vergleich zu gesunden Hunden und der caninen Wildtyp FVIII cDNA. Dies deutet darauf hin, dass sich der für Hämophilie A verantwortliche genetische Defekt bei diesem Hund weder in der kodierenden Region noch im Bereich dern Exon-Intron-Grenzen des caninen FVIII-Gens befindet. Leider war die DNA-Probe des zweiten verdächtigen Trägers mit humaner, genomischer DNA kontaminiert, so dass die Analyse der Mutation nicht möglich war.           Der für die Hämophilie A bei der Deutschen Dogge verantwortliche genetische Defekt  wurde als c.6217T>C-Punktmutation im Exon 21 des caninen FVIII Gens identifiziert. Dieser Basenaustausch führt zum Ersatz von Tryptophan durch Arginin an der Aminosäureposition 2073 in der C1-Domäne des caninen FVIII-Proteins. Dieser Aminosäure-Austausch ist relevant für das FVIII-Molekül wegen der großen Unterschiede in Ladung, Polarität und Struktur zwischen diesen Aminosäuren. Als weiteren Hinweis auf die Kausalität dieser Mutation war das Ergebnis des Screenings der genomischen DNA von zehn gesunden Doggen zu werten. Keine der gesunden Doggen wies die beschriebene Mutation auf. Zur weiteren Untersuchung der Bedeutung dieser Mutation wurden Proteinmodelle erstellt. Analyse und Vergleich der Proteinstrukturen zeigten, dass sich in der Nähe der ausgetauschten Aminosäure ein mögliches aktives Zentrum befindet und die Struktur des FVIII-Moleküls vom Wildtyp abweicht. Die Ergebnisse der genetischen Analyse des FVIII-Gens beim Pudel-Mischling ließen darauf schließen, dass eine 40-46 bp Insertion in Exon 14 des FVIII-Gens die ursächliche Mutation für den hämophilen Phänotyp bei diesem Hund war. Die identifizierte Insertion enthielt eine kurze Sequenz (TAAAG), gefolgt von einem Poly-A-Schwanz (20-26 bp), und wurde flankiert durch eine DNA-Duplizierung (15 bp). Die Analyse der Insertion zeigte, dass durch einen Frameshift ein vorzeitiges Stop-codon "TAA" zu Beginn der Insertion (c.3217-3219) entstand, das wahrscheinlich ein Translationsprodukt mit einer Länge von 1072 Aminosäuren ergibt. Diesem verkürzten Protein würden ca. 59 % der Aminosäuren der B-Domäne sowie die komplette A3-, C1- und C2-Domäne fehlen. Zusätzlich wurden vier bekannte SNPs identifiziert: c.141C>T, c.2943G>A, c.3608C >T und c.5292C>T. Fazit: Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bestätigen die Annahme, dass der caninen Hämophilie B und A bei verschiedenen Hunderassen unterschiedliche molekulare Veränderungen zugrunde liegen, wie auch bei der menschlichen Hämophilie B und A bestätigt wurde. Die Entwicklung spezifischer genetischer Screening-Tests, die auf den identifizierten Mutationen basieren, könnten mögliche Träger identifizieren. Diese Daten wären sehr hilfreich für die Kontrolle das Auftretens dieser Hämostasestörung beim Hund.

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Alcaraz Rodríguez, Patricia: Molecular genetic analysis of haemophilia A and B in several dog breeds. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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