Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Funktionalisierung eines Biomaterials zur programmierten Stammzelldifferenzierung mittels sequentieller Wachstumsfaktorfreisetzung

Brunnemann, Maren

The goal of this study was to develop a bioactive implant, which by combining different binding methods should be capable of a sequential release of different growth factors, in order to control stem cell differentiation. Using stem-cell based chondrogenesis, a sequential release of FGF-2, TGF-ß1 and IGF-1 was developed to control stem cell growth, chondrogenic differentiation and maturation to stable chondrocytes. By using different binding-techniques in combination with the carrier, the release kinetic should be controlled. As a release carrier, we used an absorbable highly porous collagen scaffold which has already shown its versatility for tissue engineering purposes. The first step of protein immobilization onto the collagen scaffold by freeze-drying was successfully accomplished. The different growth factors showed no homogenous time-release kinetics. The next step was the immobilization of the growth factor protein onto the collagen scaffold by biotin/streptavidin binding. For this purpose, it was necessary to prepare and characterize the biotinylated collagen scaffold. This appeared to have similar characteristics as the original scaffold. Finally, biotinylated IGF-1 successfully incorporated onto the modified scaffold. Through optimization of the biotin/streptavidin binding technique and change of cell culture parameters (cultivation medium, duration of chondrogenic differentiation etc.), scaffolds with MSCs showed typicalö features of succesfull chondrogenic differentiation after 28 days. After 14 days, cartilage neoformation showed the greatest effect and the IGF-1 release was extended over the whole trial period. The combined growth factor release out of the collagen scaffold was also analyzed. TGF-ß1 and FGF-2 were bound by freeze-drying and IGF-1 was immobilized by biotin/streptavidin binding onto the biotinylated scaffold. These scaffolds were then colonized with MSCs followed by a chondrogenic differentiation period. The histological and biochemical results clearly demonstrated that after 42 days, cartilage formation had appeared. However, FGF-2 adversely affected the results. For that reason, a detailed examination of the FGF-2 impact was performed, in another in vitro experiment. Freeze-dried FGF-2 significantly reduced chondrogenic differentiation of MSCs cultured in the collagen scaffold, which was additionally equipped with biotinylated IGF-1 and freeze-dried TGF-ß1. In view of the programmed stem cell differentiation, the application of 1 µg FGF-2 in the presence of biotinylated IGF-1 and TGF-ß1, has decreased neochondrogenesis. In summarising the results we can conclude, that by using the analyzed factors, a programmed differentiation by either stimulating or reducing the cartilage formation can occur. For chondrogenic differentiation, the two growth factors IGF-1 (biotin/streptavidin) and TGF-ß1 (freeze-drying) were sufficient for stimulation of cartilage formation by mesenchymal stem cells. A suchlike prepared scaffold is therefore an ideal candidate for the regeneration of cartilage tissue.

Ziel dieser Studie war es, ein bioaktives Implantat zu entwickeln, welches mit Hilfe unterschiedlicher Bindungstechniken in der Lage ist, drei verschiedene Wachstumsfaktoren zeitlich versetzt abzugeben und somit gezielt die Differenzierung von MSCs zu steuern. Am Beispiel der stammzellbasierten Chondrogenese sollte über zeitlich versetzte FGF-2, TGF-ß1 und IGF-1 Freisetzung eine optimierte Steuerung von Wachstum, chondrogener Differenzierung und Reifung von MSCs zu stabilen Chondrozyten erreicht werden. Die Freisetzungskinetik dieser Faktoren sollte steuerbar werden, indem unterschiedliche Bindungsmethoden an das Trägermaterial gewählt wurden. Als Träger wurde sich in der vorliegenden Arbeit für hoch poröse kollagen Scaffolds entschieden, die bereits ihre vielseitige Einsetzbarkeit in Tissue Engineering Anwendungen demonstrieren konnten. Der erste Schritt der Proteinimmobilisierung auf die Kollagenmatrix durch Lyophilisation wurde erfolgreich durchgeführt. Die unterschiedlichen Wachstumsfaktoren zeigten dabei kein einheitliches Freisetzungsprofil. Ein weiterer Schritt war die Anbindung von Wachstumsfaktor-Protein an den Träger durch Biotin/Streptavidin Bindung. Hierzu war zunächst die Herstellung und Charakterisierung des biotinylierten Kollagenträgers notwendig. Dieser zeigte dabei ähnliche Eigenschaften wie der ursprüngliche Träger. Schließlich konnte biotinyliertes IGF-1 erfolgreich an den modifizierten Träger gebunden werden. Nach Optimierung der Biotin/Streptavidin Bindungstechnik und Änderung verschiedener Zellkulturparameter (Kultivierungsmedium; chondrogene Differenzierungsdauer etc.) zeigten mit MSCs besiedelte Kollagen Typ II Scaffolds nach 28 Tagen eindeutige Merkmale einer gelungenen chondrogenen Differenzierung. Der Effekt auf die Knorpelneubildung war nach 14 Tagen Kultur am stärksten ausgeprägt und die Freisetzung von IGF-1 erstreckte sich über den gesamten Versuchszeitraum. Als nächstes erfolgte die kombinierte Wachstumsfaktorfreisetzung aus dem kollagenen Scaffold. Mittels Lyophilisation wurde TGF-ß und FGF-2, IGF-1 mittels Biotin/Streptavidin an den biotinylierten Träger gebunden. Entsprechende Träger wurden mit MSCs besiedelt und chondrogen differenziert. Die histologischen und biochemischen Ergebnisse zeigten dass es nach 42 Tagen eindeutig zu einer Knorpelneubildung gekommen war. Lyophilisiertes FGF-2 hatte aber das Ergebnis deutlich nachteilig beeinflusst. Aus diesem Grund wurde in einem weiteren in vitro Experiment der Effekt von FGF-2 detailierter untersucht. Es zeigte sich, dass auflyophilisiertes FGF-2 die chondrogene Differenzierung der MSC auf dem Kollagenträger, der zusätzlich mit biotinyliertem IGF-1 und auflyophilisiertem TGF-β ausgestattet wurde, signifikant reduzierte. Mit Blick auf die programmierte Stammzelldifferenzierung scheint damit das Aufbringen von 1µg FGF-2 die Neochondrogenese in Gegenwart von biotinyliertem IGF-1 und TGF-β nachteilig beeinflusst zu haben. In der Zusammenfassung muss aus den erzielten Resultaten geschlossen werden, dass eine programmierte Differenzierung mit Stimulierung oder Reduktion der Knorpelneubildung für die untersuchten Faktoren erfolgen kann. Für die chondrogene Differenzierung reichten die beiden Wachstumsfaktoren IGF-1 (Biotin-Streptavidin), TGF-β (Lyophilisation) aus, um ein deutliche Stimulierung der Knorpelneubildung mesenchymaler Stammzellen zu erreichen. Damit ist ein derartig aufgerüstetes Kollagen-Implantat ein aussichtsreicher Kandidat für die Regeneration von Knorpelgewebe.

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Brunnemann, Maren: Funktionalisierung eines Biomaterials zur programmierten Stammzelldifferenzierung mittels sequentieller Wachstumsfaktorfreisetzung. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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