Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Pharmakokinetik von Salicylsäure nach oraler Applikation von Acetylsalicylsäure beim Pferd

Buntenkötter, Kathrin

The aim of this study was to investigate, how acetylsalicylic acid and its metabolite salicylic acid are eliminated from the body. Acetylsalicylic acid was given orally in three different concentrations. Furthermore for acetylsalicylic acid and salicylic acid the IC50 for COX I and II inhibition was to be determined in vitro by means of a whole blood assay. The urine and plasma samples were analyzed at the Institute of Biochemistry at the German Sports University Cologne. For the analysis of the urine samples an existing method was altered, whereas for the plasma analysis a new method was established. Validation of both methods regarding precision, stability, linearity, accuracy, selectivity and recovery was done under EHSLC criteria. Moreover the effect of dilution on the precision was tested. The limit of quantification was determined to be 5 µg/ml in urine and 0,3 µg/ml salicylic acid in plasma. The limit of detection was set at 1 µg/ml in urine and 0,1 µg/ml salicylic acid in plasma. The study was conducted in a cross-over design. Eight horses were given the three different concentrations of acetylsalicylic acid at 12,5 mg/kg, 25 mg/kg and 50 mg/kg bodyweight. Acetylsalicylic acid was given orally, the compound used was Pyrinagil. Urine and plasma samples were taken on different points of time. Before analysis the urine samples underwent solid phase extraction and were evaporated to dryness, for the plasma samples a direct injection was selected. The internal standard was d4-Salicylic Acid. Mean maximum levels of salicylic acid were detected in urine two hours post application with about 2675 µg/ml and in plasma at 1,5 h with about 17 µg/ml, when given 12,5 mg/kg acetylsalicylic acid. After giving 25 mg/kg mean maxima were detected at two hours at about 2785 µg/ml in urine and about 23 µg/ml in plasma at 1,5 hours. Five hours after application of 50 mg/kg acetylsalicylic acid the peak is at about 3915 µg/ml in urine, while in plasma the peak occurs at about 45 µg/ml at 1,5 hours. In an additional pharmacodynamic in vitro study acetylsalicylic acid, salicylic acid, flunixin-meglumine and phenylbutazone were given in the concentration range of 0,1 to 1000 µmol/l to whole blood of six horses. The inhibition of Cyclooxygenases I and II was determined with the formation of TXB2 and PGE2 respectively in an enzyme linked immunosorbent assay. For acetylsalicylic acid the IC50 for COX I inhibition was calculated to be 1,17 µmol/l and that for COX II inhibition was 12,25 µmol/l. It was not possible to calculate an IC50 for either COX I or COX II for salicylic acid due to a lack of inhibition on either of the two cyclooxygenases. The IC50 for flunixin-meglumine is less than 0,1 µmol/l for COX I and about 0,1 µmol/l for COX II, whereas the IC50 for phenylbutazone can be compared with that for acetylsalicylic acid. After administering acetylsalicylic acid orally the set thresholds (German National Federation 625 µg/ml in urine and 5,4 µg/ml in plasma; FEI 750 µg/ml in urine und 6,5 µg/ml in plasma) are exceeded.

Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, an acht Pferden das Ausscheidungsverhalten von Acetylsalicylsäure und dem Abbauprodukt Salicylsäure nach oraler Applikation in drei verschiedenen Dosierungen zu überprüfen. Des Weiteren sollte in einem In-vitro-Versuch für die Substanzen Acetylsalicylsäure und Salicylsäure die IC50  von COX I und II im Blut bestimmt werden. Die Untersuchung der Urin- und Plasmaproben auf Salicylsäure erfolgte mittels HPLC/MS/MS im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln. Für die Untersuchung der Urinproben wurde eine bereits bestehende Analysemethode modifiziert, während für die Untersuchung der Plasmaproben eine neue Methode eingesetzt wurde. Beide Verfahren wurden anhand folgender Parameter nach EHSLC Kriterien validiert: Präzision, Stabilität, Linearität, Richtigkeit, Nachweisgrenze, Quantifizierungsgrenze, Selektivität und Wiederfindung. Außerdem wurde gezeigt, dass auch nach der Probenverdünnung eine hinreichend genaue Bestimmung der Salicylsäurekonzentration gegeben ist. Für Salicylsäure konnte eine Quantifizierungsgrenze von 5 µg/ml im Urin und 0,3 µg/ml im Plasma festgelegt werden. Die Nachweisgrenze ist mit 1 µg/ml im Urin und 0,1 µg/ml im Plasma bestimmt worden. Im Vor- und Hauptversuch wurden acht Pferden im Cross-over Design die drei Acetylsalicylsäuredosierungen 12,5 mg/kg KGW, 25 mg/kg KGW und 50 mg/kg KGW oral appliziert. Das verwendete Präparat war Pyrinagil. Anschließend wurden einem Studienplan folgend Urin- und Plasmaproben gewonnen. Die Aufarbeitung der Urinproben erfolgte mit einer Festphasenextraktion und nachfolgender Evaporation am Rotationsverdampfer, während für die Plasmaproben die Direktinjektion gewählt wurde. Als interner Standard diente d4-Salicylsäure. Die maximal erreichten Salicylsäurekonzentrationen treten im Durchschnitt nach einer Applikation von 12,5 mg/kg KGW Acetylsalicylsäure nach zwei Stunden im Urin mit einer Konzentration von ca. 2675 µg/ml und im Plasma nach 1,5 Stunden mit ca. 17 µg/ml Salicylsäure auf. Nach einer Applikation von 25 mg/kg KGW Acetylsalicylsäure ist im Mittel das Maximum an Salicylsäure nach zwei Stunden im Urin mit einer Konzentration von ca. 2785 µg/ml und im Plasma nach 1,5 Stunden mit ca. 23 µg/ml Salicylsäure zu erwarten. Bei Applikation von 50 mg/kg KGW Acetylsalicylsäure liegt die zu erwartende höchste Konzentration bei ca. 3915 µg/ml fünf Stunden nach der Applikation und im Plasma bei 45 µg/ml Salicylsäure nach 1,5 Stunden. In einer zusätzlichen pharmakodynamischen In-vitro-Studie wurde die Hemmung der Cyclooxygenasen I und II durch Acetylsalicylsäure, Salicylsäure, Flunixin-Meglumin und Phenylbutazon in den Konzentrationen 0,1 bis 1000 µmol/l in einem Vollblut Assay getestet. Für die Acetylsalicylsäure wurde eine IC50 für die COX I-Hemmung von 1,17 µmol/l und eine IC50 für die COX II-Hemmung von 12,25 µmol/l berechnet. Eine Berechnung der IC50 für die Salicylsäure war aufgrund der mangelnden hemmenden Wirkung auf die beiden Cyclooxygenasen nicht möglich. Für Flunixin-Meglumin ist die IC50 für COX I bei kleiner als 0,1 µmol/l und für die COX II bei 0,1 µmol/l anzusiedeln, Phenylbutazon verhält sich wie Acetylsalicylsäure. Nach oraler Applikation von Acetylsalicylsäure werden die bestehenden Grenzwerte für Salicylsäure kurzzeitig überschritten (FN mit 625 µg/ml im Urin und 5,4 µg/ml im Plasma und FEI mit 750 µg/ml im Urin und 6,5 µg/ml im Plasma). Über eine Erhöhung der Grenzwerte sollte nachgedacht werden.

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Buntenkötter, Kathrin: Untersuchung zur Pharmakokinetik von Salicylsäure nach oraler Applikation von Acetylsalicylsäure beim Pferd. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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