Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analysis and improvement of the in vitro transfection efficiency of plasmid-DNA encoding for equine IL-12 used for melanoma therapy in horses

Durán Graeff, María Carolina

In horses studies targeting equine melanoma therapy using DNA encoding for cytokines as interleukin 12 (IL-12) have shown some promising results. Nevertheless, complete remission after treatment has been only observed in few cases. A possible explanation for this outcome could be reduced therapy efficiency. Reproducibly high transfection rates with low methodology-induced cytotoxic side effects are essential to attain the required effect on targeted cells when exogenous DNA is transfected. Different approaches and modifications such as the use of nanoparticles (NPs) are being evaluated to increase transfection efficiencies. Transfection efficiency and methodology-induced cytotoxicity were here analysed after transfection with different NP-mediated and conventional approaches using eukaryotic DNA-expression-plasmids and mammalian cell lines. The addition of gold nanoparticles (AuNPs) to the transfection protocols significantly increased transfection efficiency when compared to a conventional FHD mediated transfection protocol (pIRES-hrGFPII-eIL-12 transfections FHD: 16%; AuNPs mean: 28%; pIRES-hrGFPII-Flexi-eIL-12 transfections FHD: 38%; AuNPs mean: 42% pIRES-hrGFPII-rHMGB1 transfections FHD: 31%; AuNPs mean: 39%) and cell vitality was mainly negatively affected by the addition of chemically generated AuNPs (Plano-AuNPs). The quantification of equine IL-12 concentrations after transfection to evaluate therapy success has been hampered by the absence of conventionally available species-specific antibodies. A method for accurate simultaneous quantification of IL-12 and IFN-gamma, key cytokines in the immune-mediated melanoma therapy, is currently missing in horses. Herein we evaluated several antibodies for cross reactivity against equine IL-12 and IFN-gamma and established a bead-based Luminex assay allowing accurate detection of this equine cytokines. The verified assays were subsequently used to quantify separately and simultaneously equine IL-12 and IFN-gamma concentrations in biological samples (stimulated PBMC supernatants, lysates/supernatants of transfected cells and equine serum). The achieved cytokine detection ranged from 31.5-5000 pg/ml and 15-10000 pg/ml for equine IL-12 and IFN-gamma, respectively. IL-12 could be accurately detected in supernatants of stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as in supernatants/cell lysates of IL-12-expression-plasmid transfected cells expressing recombinant equine IL-12. The accurate detection of equine IL-12 in serum samples was also analysed. The bead-based detected IFN-gamma concentrations in supernatants of stimulated PBMCs were comparable to the concentrations detected by anti-equine-IFN-gamma ELISA analyses. Using this new diagnostic tool, two of the main cytokines involved in IL-12-mediated equine melanoma therapy can now be accurately evaluated and used for further development and improvement of therapeutic approaches. Considering the potent antigen-presenting capacity and ability to induce an effective immune response as well as the important role of dendritic cells (DCs) in the immune mediated tumor therapy, the use of these cells in further equine melanoma studies could increase therapy outcomes in melanoma bearing horses. However, the generation efficiency of DCs in horses from adherent PBMCs is currently still poor. Therefore, herein a simple short protocol was established to enhance equine DC generation by using a human CD14 monoclonal antibody (mAb) and an automated magnetic activated cell sorting (MACS) system. Prior selection the mean percentage of CD14+ cells in the total cell population was 5.5%, further gaiting of this cell population resulted in 78.46% CD14+ monocytes. After the positive selection the mean percentage of CD14+ cells in the population was 98% without affecting viability. After 4 days of culture, DC yield was 2-fold higher than in previous published outcomes. In summary, the present study analysed and improved the in vitro transfection efficiency of equine IL-12.  The IL-12 production after transfection was quantified using a Luminex bead-based technology. Furthermore, through an automated CD14+ cell separation protocol the number of generated DCs after culture was significantly increased.

Der Einsatz von DNA kodierend für Zytokine wie z.B. Interleukin 12 (IL-12) in der Melanom Therapie beim Pferd erwies vielversprechende Erfolge. Dennoch konnte eine komplette Remission nach der Behandlung nur in wenigen Fällen beobachtet werden. Eine reduzierte therapeutische Effizienz könnte dieses Ergebnis erklären. Die exogene DNA Transfektion erfordert Reproduzierbar hohe Transfektionseffizienz bei geringen zytotoxischen Nebenwirkungen um die gewünschte Wirkung in den Zielzellen zu erreichen. Unterschiedliche Ansätze und Änderungen wie z.B. die Verwendung von Nanopartikeln (NPs) wurden eingesetzt um diese Transfektionseffizienz zu erhöhen. In dieser Arbeit wurden Säugetier-Zelllinien mit eukaryotischen DNA-expressions-Plasmide und unterschiedlichen NP-Vermittelte und konventionellen Transfektionsmethoden transfiziert um die Transfektionseffizienz und Methodik-Induzierte Zytotoxizität zu untersuchen. Die Zugabe von Gold NPs (AuNPs) zu den Transfektionsansätzen erhöhte signifikant die Transfektionseffizienz im vergleich mit konventionellen FugeneHD (FHD) vermittelte transfections Protokolle (pIRES-hrGFPII-eIL-12 Transfektion, FHD: 16%; AuNPs: 28%; pIRES-hrGFPII-Flexi-eIL-12 Transfektion, FHD: 38%; AuNPs: 42%; pIRES-hrGFPII-rHMGB1 Transfektion, FHD: 31%; AuNPs: 39%). Die Vitalität der Zellen wurde vor allem durch die Zugabe von chemisch erzeugten AuNPs (Plano-AuNPs) negativ beeinflusst. Der Nachweis der IL-12 Konzentrationen nach der IL-12 Transfektion wurde bis jetzt beim Pferd wegen mangelhafter Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern verhindert. Ein Verfahren zur genauen und simultane Quantifizierung von IL-12 und IFN-gamma, Schlüssel Zytokine in der Immun-Vermittelte Melanomtherapie, war nicht vorhanden. Deswegen wurden in dieser Arbeit verschiedene Antikörper auf Kreuzreaktivität mit equines IL-12 und IFN-gamma getestet um daraufhin die adäquaten Antikörper für die Etablierung einer Bead-basiertes Luminex Methode einzusetzen. Die etablierte Methode wurde anschließend verwendet, um getrennt und simultan equine IL-12 und IFN-gamma-Konzentrationen in verschiedenen Proben zu quantifizieren (Überstände von stimulierten PBMC, Lysate / Überständen von transfizierten Zellen und Pferdeserum). Der Zytokin-Nachweis-Bereich für equines IL-12 reichte von 31,5 bis 5000 pg / ml und für equines IFN-gamma von 15 bis 10.000 pg / ml. IL-12 konnte auch in Überständen von stimulierten PBMCs und in Überständen / Zelllysaten von IL-12-Expression-Plasmid transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde auch die IL-12 Konzentration in Pferde Serum bestimmt. Die ermittelten IFN-gamma Konzentrationen in Überständen von stimulierten PBMCs mittels der etablierten Bead-basierte Methode waren vergleichbar mit den gemessenen Konzentrationen mittels ein anti-equines IFN-gamma ELISA Verfahren. Mit dieser neu etablierten Methode konnten zwei der wichtigsten Zytokine die in der equinen Melanom Therapie involviert sind nachgewiesen werden und somit kann diese Methode für die weitere Entwicklung und Verbesserung von therapeutischen Ansätzen verwendet werden. Zusätzlich konnte die Effizienz der Generierung von Dendritischen Zellen (DCs) aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) beim Pferd gesteigert werden. DCs haben eine potente Antigen-Präsentierende Kapazität, stimulieren eine wirksame Immunantwort und spielen eine wichtige Rolle in der Immun-Vermittelten Tumortherapie. Deren Einsatz bei Melanom erkrankten Pferden könnte zu einer höheren Therapie Effizienz führen. Allerdings ist derzeit die Effizienz der DCs Generierung bei Pferden aus anhaftenden PBMCs noch unzureichend. Um diese Effizienz zu verbessern, wurde ein Protokoll etabliert wo ein humaner CD14 mononuklearer Antikörper zusammen mit einer automatisierten magnetischen Zellsortierung (MACS) eingesetzt. Vor der Zellsortierung war der Anteil von CD14+ Zellen in der gesamten Zellpopulation 5,5% und 78,46% der Monozyten CD14 +. Nach der positiven Selektion mittels MACS waren 98% der Zellen CD14+ die eine adequate Zell-Vitalität zeigten. Die 4-Tägige Kultur der Zellen erwies eine 2-Fach höhere DC Ausbeute als die aus vorherigen berichteten Ergebnissen. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Studie die in vitro-Transfektionseffizienz von equinen IL-12 analysiert und verbessert. Zusätzlich konnte die IL-12-Produktion nach der Transfektion durch die Etablierung einer Bead-basierte Luminex Methode quantifiziert werden. Darüber hinaus wurde auch durch ein automatisiertes CD14+ Zellsortierungs-Protokoll die Anzahl der generierten DCs nach Kultur signifikant erhöht. 

Quote

Citation style:

Durán Graeff, María Carolina: Analysis and improvement of the in vitro transfection efficiency of plasmid-DNA encoding for equine IL-12 used for melanoma therapy in horses. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export