Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Development and structural plasticity of the locust olfactory pathway

Eickhoff, René

The locust olfactory pathway is well studied with respect to morphology and function, yet little is known about its development and its plastic capacities during adult life. In insects the primary olfactory integration centers are the antennal lobes. Here, olfactory receptor neurons from the antennae synapse with olfactory projection neurons which relay olfactory information to second order processing centers, the mushroom bodies. These brain centers are composed of thousands of Kenyon cells. Mushroom bodies have been implicated in multimodal sensory information processing and memory formation. This thesis examines the development and the regeneration properties of the olfactory centers (antennal lobes, mushroom bodies) in the locust Locusta migratoria. I utilized monoclonal antibodies against membrane associated developmental guidance cues such as Semaphorin 1a (Sema 1a) and Fasciclin I (Fas I) as embryonic markers and provide a comprehensive description of antennal lobe and mushroom body development. Because Kenyon cells were generated throughout larval stages I extended the analyses to postembryonic mushroom body formation demonstrating that outgrowing Kenyon cells in larvae retain the embryonic expression pattern of Sema 1a and Fas I. To obtain an anatomical reference for subsequent developmental studies I initially revisited mushroom body anatomy in adult brains. Combining DC0 immunocytochemistry with DiI labeling, I resolved previously unrecognized accessory lobelets arising from class III (gustatory) Kenyon cells. The NO/cGMP pathway is known as critical modulator of axon outgrowth and guidance. In collaboration with colleagues I followed the embryogenesis of the NO/cGMP system in the locust brain using various cytochemical markers. Putative NO-synthesizing cells were identified using the NADPH-diaphorase technique whereas enzymatic activity of Nitric oxide synthase (NOS) was analyzed using citrulline immunolabeling. To visualize NO-sensitive neurons I used cGMP immunocytochemistry after bath application of an NO-donor in presence of the soluble guanylyl cyclase (cGC) activator YC-1 and the phosphodiesterase-inhibitor isobuthyl-methylxanthine (IBMX). For the olfactory pathway these markers did not provide conclusive evidence for a role of the NO/cGMP system in axon extension or growth cone navigation, because NOS expression and activity occurred only at the end of embryogenesis. In the second section of this work the locust olfactory pathway was introduced as model system for regeneration. Olfactory receptor neurons were axotomized by crushing the antennal nerve. Using conventional microscopy, we followed the resulting degeneration and regeneration in the antennal lobe, by measuring its size and by anterograde dye labeling of regenerating axons. Within three days post crush antennal lobe size was reduced by 30% and from then onward regained size almost back to normal within two weeks. Regenerating olfactory receptor axons re-innervated antennal lobe glomeruli and expressed the developmental cell surface molecules Lachesin and Fas I. In a second regeneration experiment we tested whether Scanning Laser Optical Tomography (SLOTy) might serve as a suitable method to monitor structural changes in whole mount brain preparations. This novel microscopic technique generates three-dimensional information of samples above millimeter size by using two different imaging modalities at the same time. In addition to the initial regeneration approach we ablated entire antennae to follow maximum degeneration and concentrated not only on the antennal lobe but also on the mushroom body calyx. Reconstructed tomographic images reliably resolved volumetric changes deep in the locust brain, thus allowing for rapid screening of structural plasticity in high throughput applications. Remarkably, SLOTy revealed that deprivation of olfactory input has a trans-synaptic effect leading to size reduction of the mushroom body calyx. This thesis provides the groundwork for various experimental approaches regarding both development and regeneration of the olfactory centers.

Die Riechbahn der Heuschrecke ist morphologisch und funktionell gut untersucht. Über die Entwicklung der Riechbahn und ihre plastischen Eigenschaften im adulten Tier ist jedoch sehr wenig bekannt. Die Antennalloben bilden das primäre Riechzentrum der Insekten. Hier treten die olfaktorischen Rezeptorneurone der Antennen in synaptischen Kontakt mit olfaktorischen Projektionsneuronen, die die Geruchsinformation an höhere Verarbeitungszentren, die Pilzkörper weiterleiten. Pilzkörper sind aus Tausenden von Kenyonzellen aufgebaut. Sie stehen in engem Zusammenhang mit multimodaler Signalverarbeitung und der Gedächtnisbildung. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entwicklung und dem Regenerationsvermögen der Riechzentren (Antennalloben, Pilzkörper) in der Wanderheuschrecke Locusta migratoria. Als embryonale Marker habe ich monoklonale Antikörper verwendet, die gegen die membranassoziierten Wegweisermoleküle Semaphorin 1a (Sema 1a) und Fasciclin I (Fas I) gerichtet sind und mit ihrer Hilfe eine umfassende Beschreibung der Riechbahnentwicklung erstellt. Da auch während der Larvalentwicklung fortlaufend neue Kenyon Zellen produziert werden, habe ich die Analysen auf die postembryonale Pilzkörpergenese ausgeweitet. Ich konnte zeigen, daß auswachsende neugeborene Kenyonzellen das embryonale Expressionsmuster von Sema 1a und Fas I aufweisen. Den Entwicklungsstudien lagen anatomische Untersuchungen an Pilzkörpern adulter Tiere zu Grunde. Mit Hilfe einer Kombination von DiI-Markierungen und DC0-Immunzytochemie konnte ich bisher unbekannte Strukturen („accessory lobelets“) darstellen, die aus gustatorischen (class III) Kenyonzellen hervorgehen. Die NO/cGMP Signalkaskade ist ein wichtiger Regulator für das Wachstum und die Wegfindung sich entwickelnder Axone. In Zusammenarbeit mit Kollegen habe ich die embryonale Entwicklung des NO/cGMP Signalweges im Heuschreckenhirn untersucht. Hierfür kamen eine Reihe zytochemischer Marker zum Einsatz. Putativ NO-synthetisierende Neurone wurden mit Hilfe der NADPH-Diaphorase Technik, enzymatische Aktivität der NO-Synthase via Citrullin-Immunfluoreszenz dargestellt. Um NO-sensitive Neurone zu identifizieren, wurden nach Applikation eines NO-Donors cGMP positive Neurone mittels immunzytologischer Markierung in Anwesenheit des Guanylatzyklase (sGC) Aktivators YC-1 und des Phosphodiesterase-Inhibitors Isobuthyl-Methylxanthin (IBMX) durchgeführt. Unsere Ergebnisse ergaben keine eindeutigen Hinweise darauf, daß die NO/cGMP Signal Kaskade eine Rolle während der Riechbahnentwicklung spielen könnte, da in den Riechzentren Marker für die NO-Synthase und für ihre Aktivität erst post-embryonal exprimiert wurden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Riechbahn der Wanderheuschrecke als Modell für Regeneration herangezogen. Olfaktorische Rezeptorneurone wurden durch Quetschen des Antennennervs axotomiert. Die dadurch resultierende Degeneration und Regeneration im Antennallobus wurde lichtmikroskopisch via Größenmessungen und anterograder Markierungen der Rezeptoraxone dokumentiert. In den ersten drei Tagen nach dem Quetschen verloren die Antennalloben 30% ihrer Größe und erreichten innerhalb von zwei Wochen wieder nahezu Ausgangsgröße. Regenerierende Axone innervierten synaptische Glomeruli und exprimierten die embryonalen Zelloberflächenmoleküle Lachesin und Fas I. In einem zweiten Regenerationsexperiment wurde getestet, ob Laser-gestützte Optische Tomographie (SLOTy) eine geeignete Methode darstellt, um volumetrische Veränderungen in unbehandelten (ganzen) Hirnen darzustellen. Dieses neue mikroskopische Verfahren generiert dreidimensionale Daten von Proben, die eine Größe von mehreren Millimetern überschreiten, während es simultan verschiedene Detektoren verwendet. Zusätzlich zum ursprünglichen Ansatz wurden ganze Antennen abgetrennt, um maximale Degeneration des Antennallobus zu erreichen. Neben den Antennalloben wurde das Augenmerk auch auf die Pilzkörper gerichtet. Rekonstruierte tomographische Aufnahmen lieferten glaubwürdige Daten über die strukturellen Veränderungen inmitten des Heuschreckenhirns. Es konnte zudem gezeigt werden, daß die Deafferentierung des Antennallobus trans-synaptische Veränderungen hervorruft die zu einer Größenreduktion des Pilzkörper Calyx führen. Die vorliegende Arbeit bietet das Fundament für eine Reihe möglicher experimenteller Ansätze um die Entwicklung und das Regenerationsvermögen der Riechzentren weiter zu erforschen.

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Eickhoff, René: Development and structural plasticity of the locust olfactory pathway. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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