Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Thrombozytenfunktionsdiagnostik beim Hund in der Durchflusskammer

Ferkau, Annika

Dynamic adhesion assays like parallel plate flow chambers are available to examine platelet adhesion and thrombus formation on a defined reactive surface, for example collagen. It is also possible to detect platelet function disorders and drug effects on platelet function. The aim of this study was to adapt methodological aspects of a well established method in human medicine using a novel biochip perfusion chamber (VenaECTM Biochip, Cellix Ltd.) for measurements with canine blood samples to assess canine platelet adhesion Different parameters like collagen type and concentration, wall shear stress and the concentration of the platelet receptor activating (PAR) 4 agonist were adapted. After definition of standardized conditions, further experiments were performed to examine the influence of bacterial infection on platelet function, as well as the influence of lipopolysaccharides (LPS) and hydroxyethyl starch (HES). To adapt methodological aspects, fluorescently stained whole citrated blood of healthy dogs (n=10) was perfused through the flow chamber across substrates coated with different concentrations (30, 200, 500 und 1000 µg/mL) of canine or bovine skin collagen. Wall shear stress ranged from 14 to 60 dynes/cm2. For platelet activation, different concentrations of PAR-4-agonist were used. After perfusion platelets attached to the collagen matrix were recorded in ten pictures. Total platelet covered area and average size of platelet covered areas were measured by planimetry. In further experiments blood samples of healthy dogs (n=16) were compared to blood samples of dogs with bacterial infection (n=8). Comparative measurements were performed using conventional platelet function assays like in vivo capillary bleeding time, platelet function analyzes (PFA®) and impedance aggregometry (Multiplate®). In addititon, blood samples of healthy dogs were incubated in vitro either with LPS (n=5) or HES (n=10). All experiments were performed with non-activated and PAR-4-agonist activated platelets. Platelet adhesion and thrombus formation was only supported by > 200 µg/mL canine collagen. Most consistent results with acceptable variability were obtained at a wall shear rate of 14 dynes/cm2, whereas higher wall shear stress only increased variability but not average size of thrombi. Platelet adhesion (activated vs. non-activated; 13000 ± 2500 vs. 2300 ± 130 µm2 total platelet covered area, P < 0.05) and average size of platelet covered areas (activated vs. non-activated; 70 ± 10 vs. 35 ± 4 µm2, P < 0.05) increased significantly by activating platelets with 1.8 mmol/L PAR-4-agonist in comparison to the non-activated control. In dogs with bacterial inflammation addition of PAR-4-agonist did not increase platelet adhesion in the flow chamber (activated vs. non-activated; 4400 ± 1600 vs. 2900 ± 900, P > 0.05) in contrast to platelets of healthy dogs (activated vs. non-activated; 9000 ± 900 vs. 3600 ± 520, P < 0.05). In vivo capillary bleeding time and PFA did not detect differences in platelet function in dogs with infection and healthy dogs. In impedance aggregometry platelets of dogs with infection showed a decreased aggregation in comparison to platelets of healthy dogs when using the agonist “collagen”. In comparison to the flow chamber, impedance aggregometry had less sensitivity and less specifity. In vitro addition of LPS significantly reduced “average thrombus size” after platelet activation with PAR-4-agonist in comparison to the activated control (LPS + PAR-4-agonist vs. control + PAR-4-agonist; 24 ± 4 vs. 38 ± 3, P < 0.05). After substitution of HES „thrombus average size“ was significantly decreased in comparison to the non-treated control (HES vs. control; 17 ± 2 vs. 27 ± 3, P < 0.05). In addition, HES treated samples were significantly less reactive than the control after PAR-4-agonist activation (HES + PAR-4-agonist vs. control + PAR-4-agonist; 26 ± 4 vs. 37 ± 3, P < 0.05). The present study indicates the necessity to adapt collagen type and concentration to assess canine platelet adhesion and thrombus formation in the flow chamber. The flow chamber detected platelet dysfunctions in dogs with inflammatory diseases, since platelets of dogs with inflammatory disease failed to respond to PAR- 4-agonist activation. In vitro addition of LPS highlighted the inhibiting effect of bacterial wall components on platelet function. Also platelet dysfunctions in association with the substitution of HES were represented in the flow chamber. This proof of principle study should be followed up by a larger prospective study that addresses the question how different types and severity of inflammation (local vs. systemic inflammation, infectious diseases, sepsis) influence platelet adhesion in the flow chamber. HES studies should be complemented by analysis of samples in the flow chamber of patients before and after the administration of HES.

In Durchflusskammern werden die Adhäsion und die Thrombusbildung von Thrombozyten auf definierten Oberflächen, wie beispielsweise Kollagen, untersucht. Auf diese Weise können Thrombozytendysfunktionen sowie der Einfluss von Medikamenten auf die Thrombozytenfunktion detektiert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Parameter einer in der Humanmedizin etablierten Methode unter Verwendung einer neuen Biochip Durchflusskammer (VenaECTM Biochip, Cellix Ltd.) anzupassen, um Messungen mit caninem Blut durchführen zu können. Methodische Aspekte wie Kollagentyp und -konzentration, Wandschubspannung und die Konzentration eines Thrombozyten aktivierenden Agonisten mussten dafür angepasst werden. Nach Festlegung von standardisierten Bedingungen wurde in weiterführenden Experimenten der Einfluss von bakteriellen Infektionen auf die Thrombozytenfunktion untersucht sowie der Einfluss von Lipopolysacchariden (LPS) und Hydroxyethylstärke (HES). Zur Etablierung der Methode wurde mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbtes Citratblut von gesunden Hunden (n=10) durch die Durchflusskammer über Substrate geleitet, die mit unterschiedlichen Konzentrationen (30, 200, 500 und 1000 µg/ml) von bovinem und caninem Kollagen beschichtet waren. Die Wandschubspannung wurde zwischen 14 und 60 dynes/cm2 variiert. Zur Thrombozytenaktivierung wurde der Protease aktivierende Rezeptor (PAR) 4 Agonist in den Konzentrationen 0,9, 1,8 und 3,3 mmol/l verwendet. Abschließend wurden 10 Fotos aufgezeichnet und mittels Planimetrie die Thrombozytenadhäsion (Thrombozyten-bedeckte Gesamtfläche in µm2) sowie die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ (in µm2) ermittelt. In den Folgeexperimenten wurden Blutproben von gesunden Hunden (n=16) mit Proben von Hunden mit bakterieller Infektion (n=8) verglichen. Zusätzlich wurden Vergleichsmessungen wie in vivo kapilläre Blutungszeit, Plättchenfunktionsanalyse (PFA 100®) und Impedanzaggregometrie (Multiplate®) durchgeführt. Des Weiteren wurden Blutproben von gesunden Hunden in vitro LPS (n=5) oder HES (n=10) zugesetzt. Alle Experimente erfolgten mit nicht-aktivierten und PAR-4-Agonist aktivierten Thrombozyten. Nur auf caninem Kollagen konnte ab einer Kollagenkonzentration von 200 µg/ml canine Thrombozytenadhäsion detektiert werden. Eine Wandschubspannung von 14 dynes/cm2 zeigte Ergebnisse mit akzeptabler Variabilität, während höhere Wandschubspannungen nur die Variabilität erhöhten, jedoch keinen Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion oder „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ hatten. Durch die Aktivierung der Thrombozyten mit 1,8 mmol/l PAR-4- Agonist erhöhten sich die Thrombozytenadhäsion (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 13000 ± 2500 vs. 2300 ± 130 µm2Thrombozyten-bedeckte Gesamtfläche, P < 0,05) sowie die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 70 ± 10 vs. 35 ± 4 µm2, P < 0,05) signifikant im Vergleich zur nicht-aktivierten Kontrolle. Bei den Hunden mit bakterieller Infektion führte die Zugabe von PAR-4-Agonist zu keiner signifikanten Zunahme der mit Thrombozyten-bedeckten Gesamtfläche (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 4400 ± 1600 vs. 2900 ± 900, P > 0,05) im Gegensatz zu den gesunden Hunden (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 9000 ± 900 vs. 3600 ± 520, P < 0,05). Mittels in vivo kapillärer Blutungszeit und PFA wurden keine Unterschiede zwischen erkrankten und gesunden Hunden detektiert. Die Impedanzaggregometrie zeigte jedoch eine signifikant verminderte Aggregation der Thrombozyten der erkrankten Hunde im Vergleich zu gesunden Hunden bei Verwendung des Agonisten „Kollagen“. Die Sensitivität und Spezifität der Impedanzaggregometrie waren allerdings im Vergleich mit der Durchflusskammer geringer, gemessen an der Aktivierbarkeit der Thrombozyten in der Durchflusskammer. Die Zugabe von LPS in vitro bewirkte eine signifikant verminderte „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ nach Aktivierung der Thrombozyten mittels PAR-4-Agonist im Vergleich zur aktivierten Kontrolle (LPS + PAR-4-Agonist vs. Kontrolle + PAR-4-Agonist; 24 ± 4 vs. 38 ± 3, P < 0,05). Die Substitution von HES reduzierte die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ im Vergleich zur Kontrolle (HES vs. Kontrolle; 17 ± 2 vs. 27 ± 3, P < 0,05). Außerdem führte die in vitro Gabe von HES zu einer verminderten Aktivierbarkeit der Thrombozyten gegenüber der Kontrolle (HES + PAR-4-Agonist vs. Kontrolle + PAR-4-Agonist; 26 ± 4 vs. 37 ± 3, P < 0,05). Die Arbeit konnte zusammenfassend zeigen, dass eine Anpassung von Kollagentyp und Kollagenkonzentration erforderlich ist, um canine Thrombozytenadhäsion und Thrombusformation in der Durchflusskammer zu erzielen. Die Durchflusskammer detektierte infektionsassoziierte Thrombozytenfunktionsstörungen beim Hund bedingt durch fehlende Aktivierbarkeit der Thrombozyten von erkrankten Tieren. Thrombozytenfunktionsstörungen des Hundes sind somit prinzipiell in der Durchflusskammer darstellbar. Die in vitro Zugabe von LPS unterstrich den hemmenden Effekt von bakteriellen Zellwandbestandteilen auf die Thrombozytenfunktion. Auch Thrombozytenfunktionsstörungen in Verbindung mit dem Zusatz von HES konnten in der Durchflusskammer dargestellt werden. Als Ausblick bietet sich eine größere prospektive Studie an, die sich mit der Fragestellung befassen sollte, in wieweit sich verschiedenste Formen und Schweregerade der Entzündung (lokale oder systemische Entzündungen, Infektionserkrankungen, Sepsis) differenziert auf die Thrombozytenadhäsion in der Durchflusskammer auswirken. Die HES Studie sollte durch Untersuchungen von Proben in der Durchflusskammer von Patienten mit Sepsis vor und nach der Gabe von HES ergänzt werden.

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Ferkau, Annika: Thrombozytenfunktionsdiagnostik beim Hund in der Durchflusskammer. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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