Thrombozytenfunktionsdiagnostik beim Hund in der Durchflusskammer

In Durchflusskammern werden die Adhäsion und die Thrombusbildung von Thrombozyten auf definierten Oberflächen, wie beispielsweise Kollagen, untersucht. Auf diese Weise können Thrombozytendysfunktionen sowie der Einfluss von Medikamenten auf die Thrombozytenfunktion detektiert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Parameter einer in der Humanmedizin etablierten Methode unter Verwendung einer neuen Biochip Durchflusskammer (VenaECTM Biochip, Cellix Ltd.) anzupassen, um Messungen mit caninem Blut durchführen zu können. Methodische Aspekte wie Kollagentyp und -konzentration, Wandschubspannung und die Konzentration eines Thrombozyten aktivierenden Agonisten mussten dafür angepasst werden. Nach Festlegung von standardisierten Bedingungen wurde in weiterführenden Experimenten der Einfluss von bakteriellen Infektionen auf die Thrombozytenfunktion untersucht sowie der Einfluss von Lipopolysacchariden (LPS) und Hydroxyethylstärke (HES). Zur Etablierung der Methode wurde mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbtes Citratblut von gesunden Hunden (n=10) durch die Durchflusskammer über Substrate geleitet, die mit unterschiedlichen Konzentrationen (30, 200, 500 und 1000 µg/ml) von bovinem und caninem Kollagen beschichtet waren. Die Wandschubspannung wurde zwischen 14 und 60 dynes/cm2 variiert. Zur Thrombozytenaktivierung wurde der Protease aktivierende Rezeptor (PAR) 4 Agonist in den Konzentrationen 0,9, 1,8 und 3,3 mmol/l verwendet. Abschließend wurden 10 Fotos aufgezeichnet und mittels Planimetrie die Thrombozytenadhäsion (Thrombozyten-bedeckte Gesamtfläche in µm2) sowie die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ (in µm2) ermittelt. In den Folgeexperimenten wurden Blutproben von gesunden Hunden (n=16) mit Proben von Hunden mit bakterieller Infektion (n=8) verglichen. Zusätzlich wurden Vergleichsmessungen wie in vivo kapilläre Blutungszeit, Plättchenfunktionsanalyse (PFA 100®) und Impedanzaggregometrie (Multiplate®) durchgeführt. Des Weiteren wurden Blutproben von gesunden Hunden in vitro LPS (n=5) oder HES (n=10) zugesetzt. Alle Experimente erfolgten mit nicht-aktivierten und PAR-4-Agonist aktivierten Thrombozyten. Nur auf caninem Kollagen konnte ab einer Kollagenkonzentration von 200 µg/ml canine Thrombozytenadhäsion detektiert werden. Eine Wandschubspannung von 14 dynes/cm2 zeigte Ergebnisse mit akzeptabler Variabilität, während höhere Wandschubspannungen nur die Variabilität erhöhten, jedoch keinen Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion oder „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ hatten. Durch die Aktivierung der Thrombozyten mit 1,8 mmol/l PAR-4- Agonist erhöhten sich die Thrombozytenadhäsion (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 13000 ± 2500 vs. 2300 ± 130 µm2Thrombozyten-bedeckte Gesamtfläche, P < 0,05) sowie die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 70 ± 10 vs. 35 ± 4 µm2, P < 0,05) signifikant im Vergleich zur nicht-aktivierten Kontrolle. Bei den Hunden mit bakterieller Infektion führte die Zugabe von PAR-4-Agonist zu keiner signifikanten Zunahme der mit Thrombozyten-bedeckten Gesamtfläche (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 4400 ± 1600 vs. 2900 ± 900, P > 0,05) im Gegensatz zu den gesunden Hunden (aktiviert vs. nicht-aktiviert; 9000 ± 900 vs. 3600 ± 520, P < 0,05). Mittels in vivo kapillärer Blutungszeit und PFA wurden keine Unterschiede zwischen erkrankten und gesunden Hunden detektiert. Die Impedanzaggregometrie zeigte jedoch eine signifikant verminderte Aggregation der Thrombozyten der erkrankten Hunde im Vergleich zu gesunden Hunden bei Verwendung des Agonisten „Kollagen“. Die Sensitivität und Spezifität der Impedanzaggregometrie waren allerdings im Vergleich mit der Durchflusskammer geringer, gemessen an der Aktivierbarkeit der Thrombozyten in der Durchflusskammer. Die Zugabe von LPS in vitro bewirkte eine signifikant verminderte „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ nach Aktivierung der Thrombozyten mittels PAR-4-Agonist im Vergleich zur aktivierten Kontrolle (LPS + PAR-4-Agonist vs. Kontrolle + PAR-4-Agonist; 24 ± 4 vs. 38 ± 3, P < 0,05). Die Substitution von HES reduzierte die „durchschnittliche Größe der Thrombozyten-bedeckten Flächen“ im Vergleich zur Kontrolle (HES vs. Kontrolle; 17 ± 2 vs. 27 ± 3, P < 0,05). Außerdem führte die in vitro Gabe von HES zu einer verminderten Aktivierbarkeit der Thrombozyten gegenüber der Kontrolle (HES + PAR-4-Agonist vs. Kontrolle + PAR-4-Agonist; 26 ± 4 vs. 37 ± 3, P < 0,05). Die Arbeit konnte zusammenfassend zeigen, dass eine Anpassung von Kollagentyp und Kollagenkonzentration erforderlich ist, um canine Thrombozytenadhäsion und Thrombusformation in der Durchflusskammer zu erzielen. Die Durchflusskammer detektierte infektionsassoziierte Thrombozytenfunktionsstörungen beim Hund bedingt durch fehlende Aktivierbarkeit der Thrombozyten von erkrankten Tieren. Thrombozytenfunktionsstörungen des Hundes sind somit prinzipiell in der Durchflusskammer darstellbar. Die in vitro Zugabe von LPS unterstrich den hemmenden Effekt von bakteriellen Zellwandbestandteilen auf die Thrombozytenfunktion. Auch Thrombozytenfunktionsstörungen in Verbindung mit dem Zusatz von HES konnten in der Durchflusskammer dargestellt werden. Als Ausblick bietet sich eine größere prospektive Studie an, die sich mit der Fragestellung befassen sollte, in wieweit sich verschiedenste Formen und Schweregerade der Entzündung (lokale oder systemische Entzündungen, Infektionserkrankungen, Sepsis) differenziert auf die Thrombozytenadhäsion in der Durchflusskammer auswirken. Die HES Studie sollte durch Untersuchungen von Proben in der Durchflusskammer von Patienten mit Sepsis vor und nach der Gabe von HES ergänzt werden.