Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

MYCN-dependent and -independent mechanisms targeting drug-induced DNA damage response and chromosomal instability in neuroblastoma cells

Gogolin, Sina

High-risk neuroblastomas are characterized by a near-di/tetraploid DNA index, structural chromosomal alterations, including MYCN amplification, and therapy resistance especially after relapse, which is associated with poor outcome. Amplified MYCN is a powerful prognostic marker in neuroblastoma and contributes to nearly all aspects of tumor formation and progression. Firstly, mechanisms were defined how MYCN interferes with drug-induced DNA damage response in neuroblastoma. Flow cytometric cell cycle analyses of 14 neuroblastoma cell lines showed that cells with amplified MYCN and/or additional aberrations of p53 and/or pRB pathway members respond to doxorubicin treatment with an impaired G1-S arrest. In contrast, drug treatment resulted in G2/M cell enrichment and was associated with cell death resistance. CDK4, CDK2 and CDK1 activity remained high in MYCN-amplified cells after drug treatment. CDK4 and CDK2 competed for p21 binding, which resulted in high CDK4 activity and an insufficient amount of p21 to inhibit CDK2 activity. High CDK4 activity resulted in phosphorylation of pRB at Ser780 and increased SKP2 expression. Inhibition of CDK4, CDK2 or CDK1 using siRNA/shRNA methodology, small molecule compounds or induction of the CDK4 upstream regulator p19-INK4D, but not p16-INK4A, restored at least partly drug-induced G1-S arrest in MYCN-amplified cells. CDK4 or CDK1 inhibition further sensitized MYCN-amplified neuroblastoma cells for doxorubicin-induced cell death. Secondly, the role of MYCN in the origin of chromosomal instability in neuroblastoma was studied. High-risk neuroblastomas were characterized by high expression of MYCN/MYC and p53/pRB-E2F target genes significantly enriched in mitosis regulation, including MAD2L1. Tetraplodization and anaphase bridges associated with lagging chromosomes incorporated in micronuclei were observed in MYCN-amplified and TP53-mutated neuroblastoma cells or cell cultures stably expressing a p21CIP1 targeting shRNA. Potential aneuploidy specific lethal genes, including MAD2L1 and CDK1, were identified in MYCN-amplified and TP53-mutated neuroblastoma cells using a functional RNAi screening approach combined with live-cell imaging. Taken together, these results show that amplified MYCN deregulates important members of the cell cycle machinery to impair (i) the G1-S checkpoint and (ii) the metaphase-anaphase checkpoint to induce replication and mitotic stress, which together with aberrations of p53 and/or pRB pathway members results in an impaired drug-induced DNA damage response and polyploidy.

Hoch-Risiko Neuroblastome sind durch einen annähernd di/tetraploiden DNA-Index, strukturelle Chromosomen-Alterationen (z.B. MYCN Amplifikation) und Therapieresistenz insbesondere der Rezidive charakterisiert, was mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Amplifiziertes MYCN ist einer der wichtigsten prognostischen Marker im Neuroblastom und trägt zu fast allen Aspekten der Tumorformation und –entwicklung bei. Zum einen wurde untersucht, inwiefern MYCN die Zellantwort auf eine medikamentös-induzierte Schädigung der DNA beeinträchtigt. Die durchflusszytometrische Analyse von 14 Neuroblastom-Zelllinien zeigte, dass insbesondere Zellen mit amplifiziertem MYCN und Aberrationen der p53 und/oder pRB Signalweg-Komponenten mit einem gestörten G1-S Arrest auf eine Behandlung mit Doxorubicin reagierten. Die Behandlung führte stattdessen zu einer Anreicherung der Zellen in der G2/M Phase. Dies war mit einer verminderten Zelltodrate assoziiert. CDK4, CDK2 und CDK1 waren auch unter chemotherapeutischer Behandlung in MYCN-amplifizierten Zellen aktiv. CDK4 und CDK2 konkurrierten um die Bindung von p21. Dies resultierte zum einen in aktivem CDK4 und zum anderen in einer ungenügenden Menge gebundenem p21 zur Hemmung der CDK2 Aktivität. Aktives CDK4 führte zur Phosphorylierung von pRB an Ser780 und einer erhöhten SKP2 Expression. Die Hemmung von CDK4, CDK2 oder CDK1 mittels siRNA/shRNA-Methodik, Kleinstmolekül-Substanzen oder Induktion des CDK4-Regulierers p19-INK4D, aber nicht p16-INK4A, stellte einen medikamentös-induzierten G1-S Arrest in MYCN-amplifizierten Zellen zumindest teilweise wieder her. Die Hemmung von CDK4 oder CDK1 sensibilisierte darüber hinaus MYCN-amplifizierte Neuroblastom-Zellen für Doxorubicin-induzierten Zelltod. Des Weiteren wurde untersucht, inwiefern MYCN an der Entstehung chromosomaler Instabilität im Neuroblastom beteiligt ist. Hoch-Risiko Neuroblastome exprimierten hochgradig MYCN/MYC und p53/pRB-E2F Zielgene, die in die Mitose-Regulation involviert sind, einschließlich MAD2L1. In MYCN-amplifizierten Neuroblastom Zellen, die zusätzlich eine TP53 Mutation aufwiesen, oder Zellen, welche stabil eine p21CIP1 spezifische shRNA exprimierten, wurde eine Tetraplodisierung der Zellen sowie sog. „Anaphase-Brücken“ beobachtet. Diese führten zur Isolation einzelner Chromosomen in Micronuclei. Die Analyse eines funktionalen RNAi Selektions-Ansatzes auf Lebend-Zellebene ermittelte eine Gruppe von möglichen Aneuploidie-spezifischen letalen Genen, inklusive  MAD2L1 und CDK1, in MYCN-amplifizierten und TP53-mutierten Neuroblastom Zellen. Übergreifend betrachtet, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass amplifiziertes MYCN wichtige Mitglieder der Zellzyklus-Maschinerie dereguliert, um (i) den G1/S-Kontrollpunkt und (ii) den Metaphase-Anaphase-Kontrollpunkt zu beeinträchtigen und Replikations- sowie Mitose-Stress zu induzieren, was zusammen mit zusätzlichen Abberationen der p53 und/oder pRB Signalweg-Komponenten die durch Chemotherapeutika-induzierte Zellantwort auf DNA-Schäden beeinträchtigt und mit Polyploidie einhergeht.

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Gogolin, Sina: MYCN-dependent and -independent mechanisms targeting drug-induced DNA damage response and chromosomal instability in neuroblastoma cells. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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