Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Targeted genetic modification of the porcine genome using zinc-finger nucleases

Hauschild-Quintern, Janet

Zinc-finger nucleases (ZFNs) are artificial molecular scissors that induce a double-strand break (DSB) at a specific site of the genome. After cleavage, error prone repair by non homologous end joining (NHEJ) can result into a reading frame shift causing a functional gene knockout (KO). This targeting method is much more efficient than conventional gene targeting, such as homologous recombination (HR). ZFNs have successfully been applied in several species, including insects, amphibians, plants, nematodes, and several mammals, including humans. Within the scope of this thesis, the first biallelic gene knockout of an endogenous gene in the porcine genome via ZFN-mediated targeting is reported. The knockout of the α1,3-galactosyltransferase (GGTA1, Gal) gene is essential for the success of pig-to-human xenotransplantation to abolish Gal-epitopes, the major antigen. Transplantation of a xenograft leads to a hyperacute rejection response (HAR) due to pre-existing antibodies in human blood against Gal-epitopes which are expressed on the surface of porcine cells. Organ survival was prolonged when porcine organs with a biallelic knockout of the GGTA1 gene had been transplanted into primate recipients. Gal-negative piglets were produced by conventional targeting. This method is very time consuming and critically depends on a knockout vector introducing the foreign DNA into the porcine genome. The biallelic GGTA1-KO mediated by ZFNs has several advantages and may lead to more viable piglets as many negative side effects of conventional gene targeting can be avoided. Due to the high targeting efficiency, a biallelic gene knockout can be achieved in only one experiment. Negative side effects by ZFN-mediated targeting, such as off-target site cleavage, only rarely occur. This thesis describes the path from wild-type fetal pig cell line to biallelic ZFN-mediated GGTA1 gene knockout animals. ZFN-mediated gene targeting in porcine cells led to a maximum of 1% biallelic GGTA1-KO cells in the cell population. Enrichment of Gal-negative cells with magnetic beads led to >95% pure cells. These Gal-negative cells were used for SCNT to produce fetuses for a first analysis and subsequently to produce live Gal-negative piglets. Cells from fetuses and piglets were analyzed by fluorescent activated cell sorting (FACS) and Gal-epitopes could not be detected. A complement lysis assay demonstrated protection of fetal ZFN-mediated GGTA1-KO cells that was similar to that of conventional HR-GGTA1-KO cells. Sequence analysis revealed that mutations mediated by ZFN binding and cleavage mostly consisted of small deletions (1 to 7 bp). Only a few insertions (4 bp) and one large deletion of 96 base pairs were observed. Most fetuses and pigs carried two different mutated GGTA1 alleles (heterozygous mutation) and three of eleven haplotyes showed the same mutation on both alleles (homozygous mutation). Unwanted side effects of ZFN-mediated gene targeting such as plasmid integration and off-target site (OTS) mutations could not be detected. Female and male Gal-negative piglets were produced by using ZFN-mediated gene targeting and SCNT. This method was much more efficient than conventional gene targeting by HR, negative side effects and gender specific differences were not observed. This study demonstrates that this new targeting tool can be successfully applied in the domestic pig to produce transgenic animals for xenotransplantation or disease models.

Zinkfinger-Nukleasen (ZFNn) sind künstlich generierte “molekulare Scheren”, die permanente genetische Veränderungen an einer spezifischen Stelle im Genom induzieren. Das Schneiden der DNA durch die Nukleasen führt zur Aktivierung eines fehleranfälligen Reparaturmechanismus der Zelle („nicht-homologe End-Verknüpfung“), wodurch eine Mutation in der Basenabfolge der DNA Sequenz entstehen kann. Ist die Mutation ausreichend groß oder führt sie zu einer Leseraster Verschiebung, kann dies zu einem funktionellen „Gen-Knockout“ (KO) führen. Für die Generierung gezielter Modifikationen im Genom ist die ZFN-Methode wesentlich effizienter als konventionelle Methoden, wie z.B. homologe Rekombination (HR). ZFNn wurden bereits erfolgreich in verschiedenen Organismen angewendet, wie z.B. Insekten, Amphibien, Pflanzen, Nematoden, und verschiedene Säugetiere, wie der Mensch. Im Rahmen dieser Studie wird der erste „biallelische Gen-Knockout“ eines endogenen Schweinegens mittels Zinkfinger-Nukleasen dargestellt. Der „Knockout“ des α1,3-Galaktosyltransferase (GGTA1, Gal) Gens ist Voraussetzung für die Verwendung von Schweinen im Rahmen der Xenotransplantation (Transplantation von Organen vom Schwein zum Menschen). Transplantationen zwischen verschiedenen Arten, wie Schwein und Pavian, führen zu einer hyperakuten Abstoßungsreaktion (HAR). Grund dafür sind die sogenannten Gal-Epitope, welche sich auf der Zelloberfläche von Schweinezellen und Gewebe befinden. Dem Menschen und Altweltaffen fehlen evolutionsbedingt diese Zuckermoleküle auf der Zelloberfläche. Stattdessen weisen sie Antikörper gegen die Gal-Epitope auf, welche bei einer Xenotransplantation das Schweinegewebe angreifen und dessen Zerstörung induziert. Das Überleben der Organe im Empfänger Organismus kann verlängert werden, indem das GGTA1-Gen ausgeschaltet wird, welches für die Generierung der Gal-Epitope verantwortlich ist. Gal-negative Schweine wurden bereits von anderen Gruppen produziert, allerdings mit der konventionellen HR Methode. Die ZFN-Methode hat mehrere Vorteile: wegen ihrer hohen Effizienz ist es möglich innerhalb eines Experimentes beide Gene auszuschalten, zudem ist keine Antibiotika Selektion notwendig. Die zufällige Integration von fremder DNA in das Genom mittels HR kann zu schädlichen genetischen Veränderungen führen. Dieses Risiko ist im Falle der ZFN-vermittelten Modifikationsmethode drastisch minimiert. Ein eventueller negativer Nebeneffekt der ZFNn könnte die Induktion von unerwünschten Mutationen im Genom sein, die allerdings nur selten vorkommen. Die folgende Doktorarbeit beschreibt den Weg von fetalen „Wildtyp“ Schweinefibroblasten hin zu „biallelischen“ ZFN-vermittelten GGTA1 „Knockout“ Schweinen. Die ZFN-vermittelte Genmodifikation von Schweinefibroblasten ergab eine maximale Effizienz von 1% im Falle des biallelischen GGTA1 „Knockouts“. Die Gal-negativen Zellen wurden mit Hilfe magnetischer „Beads“ angereichert, was mit >95%iger Reinheit gelang. Die Gal-negativen Zellen wurden für den somatischen Zellkerntransfer eingesetzt, um einerseits Feten für erste Analysen, und andererseits lebende Gal-negative Schweine zu produzieren. Zellen der modifizierten Feten und Schweine wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, es konnten keine Gal-Epitope nachgewiesen werden. Eine „Komplement-Lysis-Prüfung“ wies einen Schutz der ZFN-vermittelten „Knockout“ Zellen vor der Lyse auf. Dieser war dem Schutze der konventionell erzeugten HR-GGTA1-KO Zellen ähnlich. Sequenz Analysen ergaben, dass die ZFN-vermittelten genetischen Veränderungen in der DNA Sequenz meist aus kleinen Deletionen (1 bis 7 bp), wenigen Insertionen (4 bp) und einer großen Deletion von 96 Basenpaaren bestanden. Die meisten Feten und Schweine hatten unterschiedliche Mutationen auf beiden Allelen (heterozygote Mutation), nur drei von elf „Haplotypen“ wiesen die gleiche Mutation auf beiden Allelen (homozygote Mutation) auf. Negative Nebeneffekte der ZFN-vermittelten Genmodifikation, wie z.B. Plasmid-DNA Integration in das Schweinegenom oder unerwünschte Mutationen an anderen Genorten, konnten nicht detektiert werden. Weibliche und männliche Gal-negative Schweine wurden mit Hilfe der ZFN-vermittelten Genmodifikation und des somatischen Zellkerntransfers erstellt. Diese Methode ist effizienter als herkömmliche konventionelle genetische Modifikationsmethoden (HR). Negativen Effekte oder Geschlechtsspezifische Unterschiede wurden nicht festgestellt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass sich ZFNn als gezielte Modifikationsmethode im domestizierten Schwein eignen, um transgene Schweine zu erstellen, welche sich für Xenotransplantation oder als Krankheitsmodelle eignen.

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Hauschild-Quintern, Janet: Targeted genetic modification of the porcine genome using zinc-finger nucleases. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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