Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm

Heitkamp, Anne-Sophie

Inflammatory bowel diseases (IBD) are recurrent inflammations of the gastrointestinal tract that can be devided into two main forms: Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Both are caused by genetic predispositions in combination with immunological and environmental factors. Susceptibility to colitis varies between C3Bir-Il10-/- and B6- Il10-/-. One factor in this model is the different expression of the protecting surface protein CD14. In vitro studies of the promoters confirmed the assumed higher activity in the susceptible C3Bir-Il10-/- strain compared with B6-Il10-/- mice. The varying expression levels were reduced to strain specific promoter polymorphisms that led to the formation of different transcription factor binding sites. In the study at hand Cd14 promoters of both strains were analyzed to identify polymorphisms that cause strain specific disease susceptibility. Therefore, the transient transfection of murine macrophages RAW264.7 was optimized and experiments were performed using XtremeGeneR HP DNA. Promoter conctructs were inserted into luciferase reporter plasmids and transfected. Transfection efficiencies were normalized by co-transfection with β-galactosidase encoding plasmids. Subsequently, cell extracts were analyzed by luciferase and β- galactosidase assays. Initially promoters of both strains were truncated in approximately 300 bp steps to identify regions that where highly influential on expression levels. To verify the presumed functions of identified binding sites, further truncations were performed. The defined sequences were eliminated to gather information on their role in promoter activity. New truncations were transfected parallel to the ones already analyzed and evaluated. Preliminary defined functions of specific binding sites were checked by site-directed mutagenesis of their core elements in a last step. Transcription factor binding sites for PPARG, SP2 (both C3Bir-Il10-/-) und OCT1 (B6-Il10-/-) were confirmed as activating elements. Truncation experiments showed SP1 (C3Bir-Il10-/-), PPARG and SP1 (both B6-Il10-/-) to have stimulating role. However, mutagenesis of the central binding elements evinced an inhibiting influence on the expression levels. OCT1 (C3Bir-Il10-/-), E2F and Pax2 (both B6-Il10-/-) appeared to be repressive at first and later emerged as activating elements. In summary, it can be stated that the strain specific Cd14 expression is caused by several divergent transcription factor binding sites and cannot be reduced to a single promoter polymorphism.

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen sind rezidivierende Entzündungen des Gastrointestinaltraktes, die sich in die beiden Haupterscheinungsformen Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn untergliedern. Sie entstehen aufgrund genetischer Pradisposition in Verbindung mit immunologischen und umweltbedingten Faktoren. Interleukin-10-defiziente (Il10tm1Cgn, Il10-/-) Mause dienen als Modell für humane CED. C3Bir-Il10-/- und B6-Il10-/- Mause zeigten eine unterschiedliche Empfänglichkeit für Colitis. Ein Faktor in diesem Modell ist die divergierende Expression des schützenden Proteins CD14. Die in vitro Untersuchung der Promotoren bestätigte die Annahme einer höheren Aktivität im suszeptiblen Stamm C3Bir-Il10-/- im Vergleich zu den suszeptiblen Mausen B6-Il10-/-. Diese ungleichen Expressionsniveaus waren auf stammesspezifische Polymorphismen zurückzuführen, die eine unterschiedliche Formierung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen zufolge hatten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Cd14-Promotoren beider Stamme analysiert, um die der unterschiedlichen Expression des Oberflächenproteins zugrunde liegenden, divergierenden Promotorelemente zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Transfektion von murinen Makrophagen der Linie RAW264.7 optimiert und die Versuche mit dem XtremeGeneR HP DNA Reagenz durchgeführt. Die Promotorkonstrukte wurden in ein Luziferasereporterplasmid eingesetzt, transfiziert und mittels Kotransfektion eines für β-Galaktosidase kodierenden Plasmids normalisiert. Abschließend wurden die Zellextrakte mittels Luziferase- und β-Galaktosidaseanalysen untersucht und ausgewertet. Zunächst wurden die Promotoren beider Stamme in annähernd 300 bp großen Schritten verkürzt, um eingrenzen zu können, in welchen Bereichen sich Zielsequenzen befanden, die entscheidenden Einfluss auf das Expressionsniveau nahmen. Um die vermuteten Funktionen der untersuchten Zielsequenzen verifizieren zu können, wurden weitere Trunkierungen vorgenommen und so gezielt einzelne Promotorelemente eliminiert. Anschließend folgten zielgerichtete Mutagenesen der zentralen Bindungselemente der untersuchten Erkennungssequenzen, um deren putative Funktionen zu überprüfen. Die Transkriptionsfaktorbindungsstellen PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10-/-) und OCT1 (B6-Il10-/-) ließen sich hinsichtlich ihrer aktivierenden Funktion verifizieren. In den Trunkierungsversuchen stellten sich SP1 (C3Bir-Il10-/-), PPARG und SP1 (beide B6- 90 Il10-/-) als anregend dar, während sich in den Mutageneseanalysen ihre hemmende Funktion zeigte. Die zunächst als inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 (C3Bir-Il10-/-), E2F sowie PAX2 (beide B6-Il10-/-) stellten sich als anregend heraus. Zusammenfassend lasst sich feststellen, dass die stammesspezifische Cd14- Expression auf den Einfluss mehrerer divergierender Transkriptionsfaktorbindungsstellen zurückzuführen ist und nicht durch einen einzigen Promotorpolymorphismus verursacht wird.

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Heitkamp, Anne-Sophie: Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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