Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von konjugierten Linolsäuren (CLA) auf das bovine Immunsystem

Hussen, Jamal

Conjugated linoleic acids (CLA) gained special attention in nutrition physiology as well as in the reduction of various health risks. Numerous studies in cell lines and in animal models suggest that CLA isomers affect various innate and adaptive immune parameters. The effect of CLA on the bovine immune system has gained less attention. In the present study, cows after calving received feed supplemented with CLA (50 or 100 g per animal and day) for 183 days. During a period from 21 days before and 256 days after calving, cellular composition of blood and the phagocytosis capacity of neutrophils was analyzed. The proliferative response of mononuclear cells  was analysed in vitro. A putative polarizing effect of CLA on adaptive immune mechanisms in vivo was tested by analyzing stimulation-induced cytokines by qRT-PCR in vitro and IgG1/IgG2 concentrations in blood serum. Directly after calving, there was a sharp decline in the number of circulating neutrophils, concomitant with a reduced number of total blood leukocytes. Among mononuclear cells, monocyte number raised after calving, whereas percentages of B- and T-cells dropped. Among T-cells the percentage of gd T-cells and CD8+ ab T-cells remained constant, while the percentage of CD4 + ab T-cells significantly dropped. Phagocytosis by neutrophils significantly dropped between day 21 a.p and day 7 p.p.. The concentration of serum IgG2 showed no changes in the last three weeks before calving, while IgG1 levels dropped continuously until the day of calving. The supplementation with CLA showed no effect on the number of blood leukocytes, granulocytes or mononuclear cells. However, phenotyping of mononuclear cells revealed that CLA supplementation selectively reduced the numbers of CD4+ ab T-cells, whereas numbers of monocytes, gd T-cells, , B-cells and CD8+ ab T-cells remained unchanged. After ceasing CLA supplementation, differences between animal groups rapidly disappeared. Addition of 50 g CLA per animal and day significantly increased phagocytosis of opsonized bacteria by neutrophils, suggesting that CLA may enhance the expression of Fcg receptors on these cells. Addition of 100 g CLA per animal and day reduced the concentration of both IgG isotypes (IgG1, IgG2) in blood serum from day 7 p.p. during the supplementation period. In milk only IgG1 concentrations dropped, suggesting, that local plasma cells secreting milk IgG2 were not affected by CLA. In vitro, the lectin (ConA) and the superantigen (SEA) induced proliferation of bovine mononuclear cells was significantly inhibited by both CLA isomers (cis9-trans11 und trans10-cis12) at tested concetration between 25 and 100 µmol/L. C9-t11-CLA showed no effect on the viability of resting bovine blood mononuclear cells in vitro, however, could reduce the number of viable SEA-stimulated MNC (due to flow cytometrically detected apoptosis). The inhibitory effect of CLA and PGJ2 on the proliferation of bovine MNC could not be blocked through GW9662, a specific inhibitor of PPARg.The weak MNC expression of PPARg, the lack of an induced expression of PTX3 (PPARg-regulated gene) and the absence of a blocking effect of the PPARγ antagonist GW9662 on CLA-mediated proliferation inhibition suggest that effects of CLA on bovine immune cells are PPARγ independent. Stimulation with the superantigen SEA resulted in a significantly higher mRNA expression of IFN-g, IL-4, IL-17 and IL-12. The addition of CLA to SEA-stimulated cells resulted in a significant reduction of all studied Th1 (IFN-g, IL-12), Th2 (IL-4, IL-10) and Th17 cytokines (IL-17), while basal expression of these cytokines was not affected by CLA. Thus, no selective Effect of CLA on a special T-helper subpopulation could be demonstrated. Since the change of IgM to IgG1- or IgG2-expressing B-cells (and to IgG1- and IgG2-secreting plasma cells) is governed by different Th cytokines, the CLA-induced simultaneous decrease of IgG1 and IgG2 concentrations in blood serum also argues against a selectivity in the Th cytokine bias by CLA. Overall, CLA seems to affect the immune defense capacity of the animal, without polarizing immune responses in cattle.

Konjugierte Linolsäuren (CLA) haben zunehmend in den letzten Jahren besondere Beachtung in der Ernährungsphysiologie sowie bei der Minderung verschiedener Gesundheitsrisiken erfahren. Zahlreiche Untersuchungen an Zelllinien sowie in Tiermodellen weisen darauf hin, dass CLA-Isomere verschiedene Parameter des angeborenen sowie des adaptiven Immunsystems beeinflussen. Über immunmodulierende Effekte von konjugierten Linolsäuren beim Rind liegen in der Literatur bislang noch keine Studien vor. In der vorliegenden Arbeit wurden Kühe nach der Abkalbung für 183 Tage über das Futter mit CLA (50 oder 100 g pro Tier und Tag) supplementiert. Über einen Zeitraum von 21 Tagen vor bis 256 Tage nach der Abkalbung wurde die Zellzusammensetzung im Blut charakterisiert, die Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten untersucht und Funktionen mononukleärer Zellen ex vivo erfasst und in vitro analysiert. Eine mögliche polarisierende Wirkung von CLA auf adaptive Immunmechanismen in vivo wurde anhand der Stimulations-induzierten Expression pro- und anti-inflammatorischer Zytokine sowie der gebildeten Antikörperisotypen IgG1 und IgG2 geprüft. Unmittelbar nach der Abkalbung kam es zu einem starken Rückgang der Anzahl zirkulierender neutrophiler Granulozyten, was mit einer reduzierten Anzahl der Gesamtleukozyten im Blut verbunden war. Unter den mononukleären Zellen rief die Abkalbung einen Anstieg des Anteils von Monozyten hervor, während der Anteil von B- sowie T-Lymphozyten zum Partus zurückging. Unter den T-Zellen blieb der Anteil der gd-T-Zellen und der CD8+ ab-T-Zellen bis zur Abkalbung konstant, während der Anteil von CD4+ ab-T-Zellen zum Partus stark abfiel. Die Phagozytoseleistung neutrophiler Granulozyten sank signifikant zwischen Tag 21 a.p und Tag 7 p.p.. Während die Konzentration von Serum-IgG2 in den letzten drei Wochen vor der Abkalbung keine Veränderung zeigte, fielen die IgG1-Werte bei allen Kühen kontinuierlich bis zum Tag der Abkalbung stark ab. Die CLA-Supplementierung zeigte keinen Einfluss auf die Anzahl von Leukozyten, Granulozyten oder mononukleären Zellen im Blut. Die Phänotypisierung mononukleärer Zellen zeigte jedoch, dass eine CLA-Supplementierung selektiv die Anzahl CD4-positiver ab-T-Zellen reduzierte, während die Anzahl von Monozyten, B-Zellen, CD8+ ab-T‑Zellen und gd-T-Zellen nicht verändert wurde,. Nach dem Absetzen von CLA normalisierten sich die Unterschiede zwischen den Tiergruppen. Der Zusatz von 50 g CLA pro Tier und Tag führte zu einer signifikant gesteigerten Phagozytose von opsonisierten Bakterien durch PMN. Möglicherweise führt die Supplementierung mit CLA zur verstärkten Expression von Fc-gamma Rezeptoren auf neutrophilen Granulozyten. Der Zusatz von 100 g CLA pro Tier und Tag senkte ab dem Tag 7 p.p über den gesamten Supplementierungszeitraum die Konzentration beider IgG-Isotypen (IgG1, IgG2) im Blut. In der Milch führte CLA nur zur signifikanten Senkung der IgG1-Konzentration. Dies lässt vermuten, dass lokale Plasmazellen, die das Milch-IgG2 sezernieren, nicht von CLA beeinflusst werden. In vitro wurde die Lektin (ConA)- und Superantigen (SEA)-induzierte Proliferation boviner mononukleärer Zellen durch die beide CLA-Isomere (Cis9-trans11 und Trans10-Cis12) im eingesetzten Konzentrationsbereich von 25 bis 100 mmol/L signifikant gehemmt. C9-t11-CLA hatte in vitro keinen vitalitätsmindernden Einfluss auf ruhende mononukleäre Zellen des Blutes, konnte allerdings die Zahl vitaler SEA-stimulierter MNC reduzieren, was durchflusszytometrisch auf die Induktion der Apoptose durch CLA zurückzuführen war. Die hemmende Wirkung von CLA und PGJ2 auf die Proliferation boviner MNC konnte durch den PPARg-Inhibitor GW9662 nicht blockiert werden. Die schwache Expression von PPARg in MNC, das Ausbleiben einer Expressionsinduktion des PPARg-reguliertes Gen PTX3  durch CLA sowie die fehlende Wirkung des PPARg-Antagonisten auf die CLA-vermittelte Proliferationshemmung sprechen dafür, dass die Wirkungen von CLA auf bovine Immunzellen PPARg-unabhängig sind. Die Stimulation mit dem Superantigen SEA führte zur verstärkten mRNA-Expression der Zytokine IFNγ, IL-4, IL17 und IL-12. Der Zusatz von CLA zu SEA-stimulierten Zellen führte zu einer signifikanten Unterdrückung aller untersuchten Th1- (IFNγ und IL-12), Th2- (IL-4 und IL-10) sowie Th17-Zytokine (IL-17), während die basale Expression dieser Zytokine durch CLA nicht beeinflusst wurde. Damit war kein selektiver T-Helfer-Subpopulations-spezifischer Effekt von CLA nachzuweisen. Da der Wechsel von IgM- zu IgG1- oder IgG2-exprimierenden B-Zellen (und damit zu IgG1- und IgG2-sezernierenden Plasmazellen) von verschiedenen Th-Zytokinen gesteuert wird, deutet der CLA-induzierte gleichmäßige Abfall der IgG1- und IgG2-Konzentrationen im Blutserum ebenfalls auf eine fehlende Selektivität von CLA in der Beeinflussung von Th-Zytokinmustern hin. Insgesamt kann CLA die Immunabwehrbereitschaft des Tieres beeinflussen ohne zu einer Polarisierung von Immunantworten beim Rind beizutragen.

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Hussen, Jamal: Einfluss von konjugierten Linolsäuren (CLA) auf das bovine Immunsystem. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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