Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mit uterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer erfolgreichen Insemination

Junge-Krämer, Sonja Lucie Sophie

During the past two decades artificial insemination in pigs has become more a more important worldwide. Optimized insemination management has led to high fertilisation rates of up to 90 %. However, at least 1 x 109 spermatozoa per AI portion are needed to succeed. This limits the efficient use of boars and ejaculates. Furthermore the application of innovative biotechnological methods in pig reproduction such as sex differentiation of spermatozoa by flow-cytometry, are margined. In order to reduce the number of spermatozoa for successful insemination, complex techniques are needed such as deep intra-uterine and laparoscopic-oviductal insemination, as bypassing the uterus avoids sperm selection. To enable conventional artificial insemination but with reduced numbers of spermatozoa, a better understanding of essential uterine mechanisms of sperm selection is needed. The aim of this thesis is to identify, by an improved understanding of sperm retention mechanisms as well as the immunological reaction of the porcine uterus, new methods to optimize artificial insemination management in the pig. Thus the following hypotheses were aligned: 1.      The retention of porcine spermatozoa in the uterus is mediated by binding of the spermatozoa to the uterine epithelial cell tissue. 2.      The interactions between spermatozoa and the epithelium are mediated by seminal plasma components. 3.      The binding of spermatozoa to uterine epithelial cells influences the gene expression in the uterus and has effects on later events such as nidation and embryonic development. In the first of two in vivo trials, pre-ovulatory gilts were artificially inseminated intra-uterine with one of five different inseminate treatments: PBS only (PBS); seminal plasma only (SP); epididymal sperm in PBS (NHS); spermatozoa in PBS (PBSSp); spermatozoa in seminal plasma (SPSp). Volumes of 80 ml were used containing 3 x 109 spermatozoa respectively. A not inseminated negative control (NC) completed the treatment groups. Two hours after treatment animals were slaughtered and the reproductive tract was extracted. One uterine horn was flushed with 20 ml PBS and then used to gain samples for histological slices as well as salvaging uterine epithelium tissue for RNA extraction for later gene expression studies. The other horn served for a gram stain to detect possible latent infections. In the gathered fluid from the uterine flush the number of spermatozoa and leukocytes was quantified. The lowest number of luminal leukocytes and coinciding with it, the highest number of retrieved spermatozoa were found in the treatment group SPSp. The RNA samples were analysed for the expression of 349 immunorelevant genes with a custom made micro-array chip. The groups NC versus SPSp showed 15 differentially regulated genes, which was the highest number in all groups compared. The expression of two genes, CD136 and PPAR-alpha, were additionally analysed on protein level using immunohistological methods. CD136 could be detected, but no significant change in the amount of CD163 protein was detected in the uterine tissue. PPAR-alpha could not be shown to be expressed in the epithelial tissue. The micro-array results were validated by quantitative PCR. In the second insemination trial the time associated kinetics of the uterine immune response were examined. After instillation of either PBS only or spermatozoa in seminal plasma to pre-puberal gilts, the reproductive tract was extracted surgically at different times post AI (15min, 2h, and 6h post “insemination” as well as time of ovulation). The succeeding investigations were undertaken in the same ways as for the first trial. Repeating the results from the first trial, the NC and the treatment group SPSp showed 17 differentially regulated genes, but shifted in time, namely after 6 hours post insemination. Also, it was observed that at time of ovulation all immunological responses in the uterus were completed. From the findings in these studies it can be summarized that: Insemination portions that contained spermatozoa as well as seminal plasma, which therefore correspond to compounds in boar ejaculates in natural service, showed the lowest number of leukocytes migrated into the uterine lumen and at the same time high numbers of retained spermatozoa. Moreover, in both trials it could be shown that contact of the uterine epithelium with spermatozoa in presence of seminal plasma lead to a significant regulation of the gene expression of the endometrium compared to the negative control. This emphasises the hypothesis that the combination of spermatozoa and seminal plasma has an significant effect on the modulation of the porcine maternal immune response after insemination. We propose that this effect on the uterine gene expression is caused by seminal plasma mediated binding of spermatozoa to the uterine epithelium even though this binding is still to be substantiated. This binding may also account for the high sperm losses. A further interesting finding of this study is that by the time of ovulation no changes in gene expression could be detected comparing inseminated and not inseminated animals. Currently on going experiments are aimed at verifying and identifying this sperm-epithelial cell binding.

Die künstliche Besamung  des Schweines hat in den letzten 20 Jahren weltweit zunehmend an Bedeutung gewonnen. Durch Optimierung des Besamungsmanagements gelingt eine hohe Fertilitätsrate von nahezu 90%. Allerdings werden hierfür Besamungsportionen mit mindestens 1 x 109 Spermien benötigt, wodurch der effiziente Einsatz von Besamungsebern eingeschränkt wird. Dieser Umstand limitiert auch die Etablierung neuer biotechnischer Verfahren in der Schweinereproduktion, hervorzuheben ist  die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien anhand der Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie. Um die benötigte Spermienzahl pro Besamungsportion senken zu können, muss auf aufwendige Techniken wie tief intrauterine Besamung und laparoskopische Eileiterbesamung zurückgegriffen werden, da bei diesen Verfahren die durch die Uteruspassage bedingte Verluste vermieden werden können. Damit die künstliche Besamung mit einer reduzierten Spermienkonzentration innerhalb der konventionellen Besamungstechniken erfolgreich durchgeführt werden kann, müssen daher grundlegende uterine Mechanismen der Spermienselektion aufgezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, anhand  eines  besseren Verständnisses sowohl der uterinen Spermienretentionsmechanismen als auch der immunologischen Reaktionen im porcinen Uterus neue Möglichkeiten für die Optimierung des Besamungsmanagements beim Schwein aufzuzeigen. Demzufolge wurden die nachstehend genannten Hypothesen aufgestellt: 1. Die Retention von Spermien im Uterus wird durch die Bindung von Spermien an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. 2. Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. 3. Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und hat dadurch Auswirkungen auf spätere Ereignisse wie Implantation und Embryonalentwicklung. In einem ersten in-vivo-Versuch wurden präovulatorischen Jungsauen eine von 5 verschiedene Inseminatvarianten intrauterin appliziert: PBS allein (PBS); Seminalplasma allein (SP); Nebenhodenschwanzsperma in PBS (NHS); Spermien in PBS (PBSSp); Spermien in Seminalplasma (SPSp). Das Inseminat hatte dabei jeweils ein Volumen von 80 ml und enthielt gegebenenfalls 3 x109 Spermien. Eine unbesamte Negativkontrolle (NC) vervollständigte die Untersuchungsgruppen. Zwei Stunden nach Behandlung wurden die Tiere geschlachtet und der Reproduktionstrakt entfernt. Auf die Spülung eines der beiden Uterushörner mit 20 ml einer PBS-Lösung folgte die Aufbereitung von Gewebeproben zur Herstellung histologischer Schnitte  und einer anschließenden Präparation des uterinen Epithelzellgewebes zur Gewinnung von RNA für Genexpressionsstudien. Das zweite Uterushorn diente einer Gramfärbung zum Ausschluss symptomloser Infektionen. Die aus dem Uterus gewonnene Spülfüssigkeit wurde hinsichtlich der Quantität rückgespülter Spermien und Leukozyten untersucht. Die geringsten Mengen der in das Uteruslumen eingewanderter Leukozyten sowie die größte Anzahl an rückgespülten Spermien konnten in der Untersuchungsgruppen SPSp gezählt werden. Die RNA-Proben wurden mittels eines speziell gefertigten Mikroarray-Chips auf die Expression von 349 immunrelevanten Genen untersucht. Der Gruppenvergleich NC versus SPSp ergaben mit 15 die meisten der differentiell regulierten Gene. Die in dieser Gruppe regulierten Gene CD163 und PPAR-alpha wurden nachfolgend mittels immunhistologischen Untersuchungen näher untersucht. Der Nachweis von CD163-Protein gelang, jedoch wurden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der detektierten Menge an CD163 im uterinen Epithelzellgewebe festgestellt. Für PPAR-alpha konnte keine Expression im uterinen Epithelzellgewebe ermittelt werden. Die Validierung der Mikroarray Ergebnisse mittels Real-time PCR zeigte weitgehende Übereinstimmungen. In einem zweiten Besamungsversuch wurde die Zeitkinetik der uterinen Immunantwort untersucht. Nach Instillation von entweder PBS allein oder Spermien in Seminalplasma in präpuberale Jungsauen wurde der Reproduktionstrakt zu verschiedenen Zeitpunkten (15 min,  2h und 6h nach Besamung, sowie zum Zeitpunkt der Ovulation) chirurgisch entfernt. Die weiteren Untersuchungen wurden gemäß dem ersten In-vivo-Versuch durchgeführt. Wie im ersten Versuchsabschnitt fanden sich hierbei im Gruppenvergleich NC versus SPSp mit 17 die meisten differentiell regulierten Gene, allerdings zeitverschoben zu 6 Stunden nach der Besamung. Ausserdem zeigte es sich, dass zum Zeitpunkt der Ovulation jegliche immunologische Reaktion des Uterus abgeschlossen war. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit schließen: Die Besamungsportionen, welche sowohl Spermien als auch Seminalplasma enthielten, also den Komponenten des Eberejakulates im Natursprung entsprachen, wiesen den geringsten Anteil ins Uteruslumen eingewanderter Leukozyten auf, bei gleichzeitig vergleichsweise hoher Rate rückgespülter Spermien. Darüber hinaus konnte in beiden Versuchsabschnitten gezeigt werden, dass es bei Kontakt des Uterusepithels mit Spermien und Seminalplasma in Kombination zu einer signifikanten Änderung im Genexpressionsmusters im Vergleich mit der Negativkontrolle kommt. Dieses verdeutlicht und unterstreicht die These, dass die Kombination aus Spermien und Seminalplasma einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Modulation der porcinen, uterinen Immunantwort hat. Es ist zu vermuten, dass die Einflussnahme auf die uterine Genexpression durch Seminalplasma-vermittelte Bindung der Spermien an das Uterusepithel erfolgt, auch wenn der eigentliche Beweis für diese Bindung noch aussteht. Diese Bindung könnte auch einen Teil der Verantwortung für die hohen uterinen Spermienverluste tragen. Ein weiterer interessanter Befund dieser Studie ist, dass jegliche Änderungen in der Genexpression zum Zeitpunkt der Ovulation nicht mehr nachweisbar sind. Derzeit laufende in-vitro Untersuchungen haben zum Ziel die Spermien-Epithelzellbindung direkt nachzuweisen und den Bindungsmechanismus zu entschlüsseln.

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Junge-Krämer, Sonja Lucie Sophie: Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mit uterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer erfolgreichen Insemination. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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