Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der peripartalen IGF-System-Expression in Uterus und Plazenta des Rindes : Nebent.

Lütkehus, Hanna

Post partum metritis and endometritis are common problems in high yielding dairy cows. Although there is almost always a bacterial contamination of the uterus due to parturition, only about half of the cows get a clinical or subclinical uterine disease. Up to date little is known about the mechanisms underlying this different susceptibility. Recent findings indicate that the IGF system as a potent growth factor system is involved in post partum re-epithelization of the endometrium. Additionally, bovine uterine diseases in the postpartal period are associated with an impaired immune function, which is in turn connected with an imbalance of the local IGF system. The resulting inflammation leads to delayed uterine involution and impairment of the embryo, which again negatively influences fertility. Therefore the aim of the study was to characterize the IGF system in uterus and placenta to localize the different components within the cells of the examined tissues, and to compare their expression quantitatively. Therefore samples were taken from intercaruncular uterine tissue and placenta of dairy cows (n=17) on day 275 of pregnancy via caesarean sections. Also placentomes of 12 dairy cows, which calved spontaneously, were taken through the vagina directly after parturition. After expulsion of the afterbirth an LPS solution was infused into the uterine lumen to cause a local inflammation. Three hours following infusion cows were sacrificed and once more samples from intercaruncular uterine tissue and caruncle were taken. The animals used for experiment were grouped according to their blood IGF values into an IGF high and an IGF low group. Tissue samples were either frozen in liquid nitrogen or fixed in Bouin’s solution and embedded in paraffin. On protein level IGF ligands (IGF-I and -II), receptors (IGF1R and IGF2R), and binding proteins (BP-2, -3, and -7) were investigated by immunohistochemistry and validated by western blot. On mRNA level, gene expression of the IGF system members was analyzed by RT-PCR and quantitatively studied by RT-qPCR. Within the intercaruncular uterine tissue, IGF system components were mainly found in luminal and glandular epithelium, but also blood vessels and myometrium showed positive reactions. Additionally, IGF-I was strongly found in stratum compactum of the endometrium. In caruncular tissue IGF-II, IGF2R, IGFBP-2, and IGFBP-7 were primarily localized in the maternal epithelium, whereas maternal stroma and blood vessels showed a weak reaction. IGFBP-3 protein was widely spread in the different cell types within the caruncular tissue. Again, IGF-I was mainly localized in maternal stroma, whereas IGF1R was found in stroma as well as in blood vessel walls. Within the cotyledonary tissue the uninuclear trophoblast was mostly positive for the IGF system members. Especially IGF-II was strongly found here. The trophoblast giant cells (TGCs) showed varying staining for the two ligands and were usually negative for the other components. The fetal stroma displayed distinct staining intensities for the different IGF members. Fetal blood vessels, on the other hand, showed generally a clear signal. A comparison between IGF high and IGF low group revealed no obvious differences in localization or staining intensities of the particular components. Likewise by quantitative comparison of IGF system mRNA expression a significant difference between the two groups could not be detected in endometrium, placenta, and caruncle. LPS Infusion induced a pronounced influx of leukocytes into the Stratum reticulare, which were positive for the majority of IGF system members. The distinct localization patterns of the IGF system components within the different cell types may be indicative of cell specific functions. The expression throughout pregnancy confirms an important assignment of the IGF system in fetal growth, which was already assumed by several authors. An auto- or paracrine action of IGF ligands via IGF1R suggest a role in post partum uterine healing, whereby the regulatory operating binding proteins and IGF2R provide for a local homeostasis within the uterus. The new insights of this study make the IGF system an interesting candidate for future research work. Whether or not modulation of IGFs may be a useful method for preventing endometritis in high yielding dairy cows remains to be elucidated.

Hochleistungsmilchkühe erkranken häufig an postpartaler Metritis und Endometritis. Obwohl die Gebärmutter während der Geburt fast immer mit Keimen besiedelt wird, entwickelt nur etwa die Hälfte der Kühe eine klinische oder subklinische Uteruserkrankung. Über die Ursachen dieser unterschiedlichen Empfänglichkeit ist bisher wenig bekannt. Forschungsarbeiten deuten darauf hin, dass das IGF-System als potentes Wachstumsfaktorsystem in den Prozess der postpartalen Reepithelisierung des Endometriums einbezogen ist. Weiterhin sind postpartale Uteruserkrankungen mit einer herabgesetzten Immunfunktion assoziiert, die wiederum mit einer Imbalanz des lokalen IGF-Systems in Verbindung gebracht werden. Die resultierenden Entzündungen führen zu einer verzögerten Involution und Schädigung des Embryos, was wiederum die Fruchtbarkeit negativ beeinflusst. Ziel dieser Dissertation war es also, das IGF-System im Uterus und der Plazenta zu charakterisieren, die einzelnen Komponenten zu lokalisieren und deren Expression zu quantifizieren. Dazu wurden bei Milchkühen (n=17) an Tag 275 der Trächtigkeit per Kaiserschnitt Proben von Plazenta und interkarunkulärem Uterusgewebe entnommen. Außerdem wurden Milchkühen (n=12) nach spontan erfolgter Geburt transvaginal Plazentome entnommen. Nach Abgang der Nachgeburt wurde eine LPS-Lösung in den Uterus infundiert, um eine lokale Entzündungsreaktion zu provozieren. Drei Stunden danach wurden die Tiere euthanasiert und Uterus bzw. Karunkeln erneut beprobt. Die Versuchstiere beider Entnahmezeitpunkte wurden anhand ihrer Blut-IGF-Werte in zwei Gruppen unterteilt (IGF-high- und IGF-low-Gruppe). Die entnommenen Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Bouin’scher Lösung fixiert und anschließend in Paraffinblöcke gegossen. Mittels Immunhistochemie und Western Blot wurden dann die IGF-Liganden (IGF-I und -II), die Rezeptoren (IGF1R und IGF2R) und die Bindungsproteine (BP-2, -3 und -7) auf Proteinebene und mittels RT-PCR und RT-qPCR auf mRNA-Ebene untersucht. Im interkarunkulären Uterusgewebe waren die IGF-System-Komponenten vor allem in luminalem und Drüsenepithel zu finden, aber auch Blutgefäße und Myometrium zeigten positive Signale. IGF-I trat außerdem besonders stark im Str. compactum des Endometriums auf. In der Uteruskarunkel wurden IGF-II, IGF2R, BP-2 und BP-7 vor allem im maternalem Epithel detektiert, das Stroma und die Blutgefäße zeigten schwächere Reaktion. Das BP-3-Protein war innerhalb der Karunkel in den verschiedenen Zellarten weit verbreitet. IGF-I befand sich vor allem im maternalen Karunkelstroma und der IGF1R neben dem Stroma auch in den Blutgefäßwänden. In der Kotyledone stellte sich der einkernige Trophoblast zumeist positiv für die untersuchten IGF-System-Komponenten dar, wobei hier besonders das IGF-II stark exprimiert wurde. Die Trophoblastriesenzellen (TGCs) waren für die Liganden unterschiedlich stark positiv, während sie bis auf einzelne Zellen für die anderen Komponenten häufig negativ waren. Das fetale Stroma zeigte bei den einzelnen Komponenten recht unterschiedlich starkes Färbeverhalten, während die fetalen Gefäße meist deutlich positiv waren. Beim Vergleich zwischen den Gruppen IGF-high und -low konnte kein Unterschied in der Lokalisation und Färbeintensität für die einzelnen Komponenten festgestellt werden. Ein Vergleich der IGF-System-Expression auf mRNA-Ebene ergab ebenfalls keinen signifikanten Expressionsunterschied zwischen den Gruppen in Endometrium, Plazentom und postpartaler Karunkel. Die LPS-Infusion führte zu einem auffälligen Einstrom von Leukozyten in das Stratum reticulare, die für die Mehrheit der IGF-Systemmitglieder positiv waren. Die unterschiedliche Lokalisation der einzelnen Komponenten in den verschiedenen Zellarten lässt auf zellspezifische Funktionen des IGF-Systems schließen. Die Expression während der Trächtigkeit bestätigt die bereits in der Literatur vermutete wichtige Aufgabe des IGF-Systems beim fetalen Wachstum. Eine auto- bzw. parakrine Ligandenwirkung via IGF1R lokal im Uterus deutet auf eine Mitwirkung an postpartalen Heilungsvorgängen hin, wobei die regulatorisch wirkenden Bindungsproteine und der IGF2R für eine lokale Homöostase im Uterus sorgen könnten. Die neuen Erkenntnisse dieser Arbeit machen das IGF-System zu einem interessanten Objekt für zukünftige Forschungsarbeiten. Ob und inwieweit eine Modulation des IGF-Systems bei der Bekämpfung von postpartalen Uteruserkrankungen eingesetzt werden kann, müsste durch weitere Experimente herausgefunden werden.

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Lütkehus, Hanna: Charakterisierung der peripartalen IGF-System-Expression in Uterus und Plazenta des Rindes. Nebent.. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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