Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Minimalistic immunologically defined gene expression T helper cell 1 (MIDGE-Th1®) vectors coding for Interleukin 12 and -18 in combination with the transfection agent SAINT-18 have systemic antitumoral effects on equine melanomas

Mählmann, Kathrin

Equine melanomas are the most common neoplasms in older grey horses. Until now, no curative therapy is established. Xenogenic DNA vaccination represents a promising therapeutic approach. Goal of the present study was to evaluate the safety and clinical efficacy of vaccination of grey horses with natural occurring melanomas with MIDGE-Th1® vectors encoding for equine (eq) IL12 and eqILRAP-IL18 alone or in combination with human gp100 (hgp100) or human tyrosinase (htyr). Three groups (each n=9) of adult grey horses with variable numbers of melanomas received three intramuscular and three intradermal peritumoral vaccinations. Each group was treated with MIDGE-Th1® vectors coding for eqIL12 and eqILRAP-IL18. One group (group gp100) was additionally treated with 500 μg hgp100MIDGE-Th1® and one group with 500 μg htyrMIDGE-Th1® (group tyr). The third group did not receive additional DNA (group IL12/18). Vectors were complexed with the transfection agent SAINT-18.The injections were performed on days 1, 22 and 78 intradermally around one selected melanoma (locally treated melanoma) and intramuscularly as a systemic treatment. A general examination of the horses and evaluation of local reactions at the injection site were performed daily during hospitalisation (on the day of each injection and 3 days after each injection as well as on day 120). In each horse the locally treated melanoma and up to 8 non-locally treated melanomas were measured before each injection and on day 120 by calliper and ultrasound. The relative volumes were calculated in relation to day 1 (100%). For the evaluation of the generation of specific CD8+ cytotoxic T-cells against hgp100 and htyr, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated before each injection and on day 120, were stimulated in vitro with autologous dermal cells transfected with hgp100 or htyr. Interferon γ (IFN γ) as a response to this specific stimulation was measured by intracellular immunofluorescence staining. Specific serum antibodies against hgp100 and htyr were measured at equivalent time points as cytotoxic T-cells using a cell based flow cytometric assay. Human embryonic kidney cells, transfected with hgp100 or htyr served as a source for antigens. The only consistent abnormal finding upon clinical examination of the treated horses was an increased body temperature. A significant increase in body temperature (38.7 ± 0.59 °C) was recorded after 40 of the 81 injections, and usually lasted for one day. Local inflammatory reactions and depigmentation were observed in all groups starting at day 3 after the first application. The relative tumor volume (%) was significantly reduced to 71.5 ± 29.73% (calliper measurements) and 87.0 ± 24.42% (ultrasound measurements). There were no significant differences detected between groups (gp100, tyr and IL12/18). No difference was seen in reduction of tumor volume between locally treated and non-locally treated melanoma. Neither a cellular nor a humoral immune response against the vaccine antigens could be detected. In this study, treatment with eqIL12 and eqILRAP-IL18 DNA in combination with SAINT-18 showed a systemic effect against grey horse melanoma. There was no additional clinical or immunological effect observed by vaccination with MIDGE-Th1® vectors encoding hgp100 and htyr. It remains unclear whether the antitumoral effect was caused by the interleukins, unmethylated CpG motifs or the induction of an immune reaction by the combination of DNA and transfection reagent. Reasons for the absence of a specific immune response may be an inadequate selection of dosages or treatment interval. It is also possible that the sensitivity of the immunoassays was too low to detect a subclinical immune response. Further studies to characterize the antitumoral effects of the treatment used in this study and modifications of the treatment protocol to achieve a potential specific immune response are warranted.

Equine Melanome sind die häufigsten Neoplasien bei älteren Schimmeln.  Bis heute ist keine kurative Therapie etabliert. Xenogene DNA Vakzination stellt einen vielversprechenden Therapieansatz dar. Ziel der vorliegenden Studie  war die Sicherheit der Anwendung, sowie klinische und immunologische Wirksamkeit einer Vakzination von Schimmeln mit natürlich vorkommenden Melanomen mit MIDGE-Th1® Vektoren kodierend für equines (eq) IL12 und eqILRAP-IL18 allein oder in Kombination mit humanem gp100 (hgp100) oder humaner Tyrosinase (htyr), zu zeigen. Drei Gruppen adulter Schimmel (je n=9) mit unterschiedlich vielen Melanomen erhielten drei intramuskuläre und drei intradermale, peritumorale Impfungen. Jede Gruppe wurde mit je 200 μg MIDGE-Th1® Vektoren kodierend für eqIL12 und eqILRAP-IL18 behandelt. Eine Gruppe (Gruppe gp100) wurde zusätzlich mit 500 μg hgp100 MIDGE-Th1® und eine Gruppe mit 500 μg htyr MIDGE-Th1® (tyr) behandelt. Die dritte Gruppe (Gruppe IL12/18) erhielt keine zusätzliche DNA. Alle Vektoren wurden mit dem Transfektionsreagenz SAINT-18 gemischt. Die Injektionen wurden an den Tagen 1, 22 und 78 intradermal an ein ausgesuchtes Melanom (lokal behandeltes Melanom) und intramuskulär als systemische Behandlung durchgeführt. Eine klinische Allgemeinuntersuchung und eine Untersuchung lokaler Reaktionen an der Injektionsstelle wurden täglich während des Klinikaufenthaltes  (am Tag jeder Injektion und drei Tage nach jeder Injektion, sowie am Tag 120) durchgeführt. Bei jedem Pferd wurden das lokal behandelte Melanom und bis zu acht weitere nicht lokal behandelte Melanome vor jeder Injektion und an Tag 120 mittels Schublehre und Ultraschall gemessen. Die relativen Volumina  wurden für jeden Untersuchungszeitpunkt in Relation zum ersten Tag (100%) errechnet. Für die Evaluation der Bildung spezifischer zytotoxischer T-Zellen gegen hgp100 und htyr wurden Periphere Mononukleäre Blutzellen (PBMCs) vor jeder Injektion und an Tag 120 isoliert und in vitro mit hgp100 oder htyr DNA transfizierten autologen dermalen Zellen stimuliert. Interferon γ (IFN γ), als Antwort auf diese spezifische Stimulation, wurde mittels einer intrazellulären Immunfluoreszenz Färbung gemessen. Spezifische Serum Antikörper gegen hgp100 und htyr wurden zu äquivalenten Zeitpunkten wie die zytotoxischen T-Zellen mit einem Zell-basierten, durchflusszytometrischem Test gemessen. Humane embryonale Nierenzellen, transfiziert mit hgp100 oder htyr DNA, dienten als Antigenquelle. Der einzig konsistente abnormale Befund in der Allgemeinuntersuchung der Pferde war eine erhöhte Körpertemperatur. Eine signifikante Steigerung der Körpertemperatur (38.5 ± 0.54 °C) wurde nach 40 der 81 Injektionen festgestellt und hielt normalerweise für einen Tag an. Lokale Entzündungsreaktionen und Depigmentation wurden in allen drei Gruppen ab dem 3. Tag nach der ersten Behandlung  beobachtet. Die relativen Tumorvolumina reduzierten sich signifikant auf  71.5 ± 29.73 % (Schublehrenmessung) und 87.0 ± 24.42 % (Ultraschallmessung). Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (gp100, tyr und IL12/18) festgestellt werden. Es wurde kein Unterschied in der Reduktion des Tumorvolumens zwischen lokal behandelten und nicht lokal behandelten Melanomen festgestellt. Es konnte weder eine zelluläre noch eine humorale Immunantwort gegen die Impfantigene festgestellt werden. Die Behandlung mit eqIL12 und eqILRAP-IL18 DNA in Kombination mit SAINT-18 zeigte in dieser Studie einen systemischen Effekt gegen das equine Melanom, während die Vakzination mit hgp100 und htyr MIDGE-Th1® Vektoren keinen zusätzlichen klinischen oder immunologischen Effekt aufwies. Es bleibt unklar, ob der antitumorale Effekt durch die Wirkung der Interleukine, durch unmethylierte CpG-Motive oder durch die Induktion einer Immunreaktion durch die Kombination von DNA und Transfektionsreagenz zustande kam. Ursachen für eine fehlende spezifische Immunreaktion können eine ungeeignete Auswahl der Dosierungen oder des Therapieintervalls sein. Zudem ist es möglich, daß die angewandten immunologischen Testmethoden eine fehlende Sensitivität aufweisen, um eine subklinische Immunantwort zu detektieren. Weitere Studien, um den antitumoralen Effekt der in dieser Studie angewendeten Behandlung zu charakterisieren und eine Modifizierung der Behandlung zur Induktion einer potentiellen spezifischen Immunreaktion zu erreichen, sind notwendig.

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Mählmann, Kathrin: Minimalistic immunologically defined gene expression T helper cell 1 (MIDGE-Th1®) vectors coding for Interleukin 12 and -18 in combination with the transfection agent SAINT-18 have systemic antitumoral effects on equine melanomas. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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