Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Antikörper-abhängige Immunantwort im SIV-Makakenmodell

Raue, Katharina

Despite comprehensive efforts, there is still no safe vaccine against the human HIV infection available. To achieve this goal further analysis of the impact of humoral immune responses on HIV as well as of B cell development and –pathogenesis are needed. The infection of Asian macaques with the Simian Immunodeficiency Virus (SIV) provides an excellent animal model for this due to its analogies regarding viral replication, immune responses and clinical aspects. The aim of this study was to evaluate the impact of antibody-dependent immune defense in the SIV-macaque-model. Therefore, in a retrospective study, animals with a classical progressive course of disease (progressors) where compared to those, which were able to control viral replication for an unusually long period of time and remained clinically healthy (long-term survivors). To assess the humoral immune response during the course of infection, binding and neutralizing antibody titers were determined by ELISA and TZM-bl neutralization assay with luciferase read-out. For comparison with the cellular immune response, data of an INF-γ-ELISpot were analyzed. Additionally, the existence of SIV-specific memory B cells in blood and BAL was tested by B cell-ELISpot. In a cross-sectional study the current phenotypic B cell subpopulations were characterized by polychromatic flow cytometry and compared to those of SIV-negative animals and animals with high viral load. Finally, 12 animals, which served as naïve controls in two immunization experiments, were monitored from the day of SIV infection to its chronic phase by the assays mentioned afore. The purpose was to evaluate the impact of B cell pathogenesis during the early phase of SIV-infection on the development of the antibody-dependent immunity. The following results were obtained: 1)     Long-term survivors had significantly higher binding antibody titers against SIVgag as well as more SIVgag-specific IFN-γ-secreting T cells than progressors. There was no difference in the humoral and cellular immune responses against SIVenv. 2)     Neutralizing antibodies were higher in progressors depending on viral load levels. 3)     Without stimulation, neither in blood nor in BAL of the long-term survivors were SIV-specific IgG- or IgA-secreting cells detectable. 4)     After in vitro-stimulation, there were more SIVenv-specific than SIVgag-specific IgG-memory B cells in the blood of the long-term survivors. There was no evidence for SIV-specific IgA-memory B cells in blood and for SIV-specific IgG- and IgA-memory B cells in BAL. 5)     The phenotypic B cell populations of SIV-negative Rhesus monkeys differed from those of healthy humans. The main percentage of B cells in Rhesus macaques consisted of activated B cells, which represented less than 10% of the human B cell pool. By contrast, humans had a considerably higher fraction of resting memory B cell subset. 6)     While activated B cells increased significantly in animals with medium and high viral load and the percentages of naïve and resting memory B cells significantly decreased, animals with low viral loads differed from SIV-naïve animals only with regard to the resting memory B cells. 7)     In contrast to the situation in human HIV infection, transitional B cells decreased after SIV infection but the percentages of exhausted tissue-like B cells remained normal. 8)     After an initial decrease during peak viremia, total B cells as well as the fraction of memory B cells recovered. 9)     There was no correlation between titers of SIV-specific antibodies and SIV-specific antibody-secreting cells, neither during acute nor during chronic phase of SIV infection. 10) SIV-specific antibody-secreting cells during the beginning of the plateau phase inversely correlated with the current viral load as well as with the viral load 40 weeks after SIV infection. These results show a clear difference between long-term survivors and progressors regarding antibody-dependent immune defense and B cell subpopulations. Additional research on the cause and effect should be carried out in terms of future immunization strategies and to improve the therapy of B cell-associated symptoms of HIV-disease.

Trotz jahrzehntelanger Bemühungen steht noch kein zuverlässiger Impfstoff zum Schutz vor der HIV-Infektion des Menschen zur Verfügung. Für das Erreichen dieses Zieles sind weitere Untersuchungen über die Bedeutung und Funktionsweise der humoralen Immunantwort einschließlich der B-Zellentwicklung und -pathogenese unerlässlich. Hierfür stellt die Infektion von asiatischen Makaken mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) aufgrund von deutlichen virologischen, immunologischen und klinischen Analogien ein hervorragendes Tiermodell dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung der antikörperabhängigen Immunantwort im SIV-Makakenmodell evaluieren. Dazu wurden in einer retrospektiven Studie Tiere mit klassisch progredientem Infektionsverlauf (Progressoren) mit solchen verglichen, die ohne Therapie dazu in der Lage waren, die Virusreplikation über einen ungewöhnlich langen Zeitraum hinweg zu kontrollieren und klinisch gesund blieben (Langzeitüberlebende). Für die Bewertung der humoralen Immunantwort im Laufe der Infektion wurden als Parameter die Titer bindender Antikörper gegen SIVgag und SIVenv und die Titer neutralisierender Antikörper genutzt, welche mittels konventionellem ELISA bzw. anhand des TZM-bl-Neutralisationstest mit Luziferase-read-out bestimmt wurden. Zum Vergleich mit der zellulären Immunantwort wurden Daten eines IFN-γ-ELISpot ausgewertet. Schließlich erfolgte eine Analyse der SIV-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen im Blut und der BAL von Langzeitüberlebenden anhand des B-Zell-ELISpots. In einer Vergleichsstudie wurden die gegenwärtigen phänotypischen B-Zellsubpopulationen der Langzeitüberlebenden durchflusszytometrisch charakterisiert und denen von SIV-negativen Tieren und solchen mit hoher Virusbeladung gegenübergestellt. Um die Einflüsse der B-Zellpathogenese in der Phase der frühen SIV-Infektion auf die Entstehung der antikörperabhängigen Immunantwort zu bewerten, wurden schließlich 12 nicht-immunisierte Tiere, die als Kontrolltiere in zwei Impfstoffstudien dienten, von der Belastungsinfektion bis hin zur chronischen Phase der SIV-Infektion mit den genannten Testmethoden untersucht. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1)     Langzeitüberlebende besaßen signifikant höhere Antikörpertiter gegen SIVgag und auch mehr T-Zellen, die IFN-γ als Reaktion auf SIVgag ausschütteten,  als Progressoren. Die humorale und zelluläre Immunantwort gegen SIVenv unterschied sich nicht zwischen Langzeitüberlebenden und Progressoren. 2)     Progressoren hatten in Abhängigkeit von der Viruslast höhere Titer von neutralisierenden Antikörpern als Langzeitüberlebende. 3)     Ohne vorherige Stimulation konnten keine SIV-spezifischen IgG- oder IgA-sezernierenden Zellen im Blut und der BAL von Langzeitüberlebenden nachgewiesen werden. 4)     Im Blut der Langzeitüberlebenden konnten nach in vitro-Stimulation mehr SIVenv-spezifische IgG-Gedächtnis-B-Zellen als SIVgag-spezifische IgG-Gedächtnis-B-Zellen detektiert werden. Der Nachweis von SIV-spezifischen IgA-Gedächtnis-B-Zellen im Blut sowie der von SIV-Spezifischen IgG- und IgA-Gedächtnis-B-Zellen in der BAL blieb erfolglos. 5)     Die phänotypischen B-Zellpopulationen von SIV-negativen Rhesusaffen unterschieden sich von denen gesunder Menschen. So bestand der größte Anteil der B-Zellen von Rhesusaffen aus aktivierten B-Zellen, welche bei Menschen weniger als 10% ausmachen. Umgekehrt besitzen Menschen deutlich höhere Prozentsätze von ruhenden Gedächtnis-B-Zellen als Rhesusaffen. 6)     Während die Anteile von aktivierten B-Zellen bei Tieren mit mittlerer und hoher Virusbeladung signifikant anstiegen und die Anteile naiver B-Zellen und ruhender Gedächtnis-B-Zellen abfielen, unterschieden sich Tiere mit sehr niedriger Virusbeladung nur hinsichtlich der ruhenden Gedächtnis-B-Zellen von SIV-negativen Tieren. 7)     Im Unterschied zu der Situation während der HIV-Infektion des Menschen fiel der Anteil von Übergangs-B-Zellen durch die SIV-Infektion ab, während sich die Anteile der exhausted tissue-like Gedächtnis-B-Zellen nicht änderten. 8)     Nach einem initialen Abfall zum Zeitpunkt der Spitzenvirämie zwei Wochen nach SIV-Infektion erholten sich sowohl die Anteile der Gesamt-B-Zellen an den Lymphozyten, als auch die der Gedächtnis-B-Zellen an den Gesamt-B-Zellen wieder. 9)     Weder in der akuten noch in der chronischen Phase der SIV-Infektion bestand eine Korrelation zwischen den Titern SIV-spezifischer bindender Antikörper und den SIV-spezifischen antikörper-sezernierenden Zellen. 10) Die SIV-spezifischen antikörper-sezernierenden Zellen korrelierten beim Eintritt in die Plateauphase negativ sowohl mit der derzeitigen Viruslast als auch mit jener 40 Wochen nach SIV-Infektion. Die Resultate der vorliegenden Arbeit konnten deutliche Unterschiede zwischen Langzeitüberlebenden und Progressoren sowohl bezüglich der antikörperabhängigen Immunantwort als auch bezüglich der B-Zellsubpopulationen aufzeigen. Eine weiterführende Untersuchung der Ursachen und Konsequenzen dieser Unterschiede sollte im Hinblick auf zukünftige Immunisierungsstrategien und für die verbesserte Therapie von B-Zell-assoziierten Symptomen der HIV-Erkrankung durchgeführt werden.

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Raue, Katharina: Antikörper-abhängige Immunantwort im SIV-Makakenmodell. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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