Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Rolle von Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke im In-vivo-Pilocarpin-Maus-Modell für Epilepsie und In-vitro-Transportuntersuchungen zu potenziellen PET-Tracern

Römermann, Kerstin

Epilepsy is one of the most common chronic neurologic disorders. Symptomatic pharmacological treatment occurs primarily with antiepileptic drugs (AEDs). Up to 75 % of patients with temporal lobe epilepsy are not permanently seizure-free under AED treatment. The mechanism of pharmacoresistance in epilepsy is not yet completely understood. One possible hypothesis in the development of pharmacoresistance is the multidrug transporter hypothesis. It is believed that the overexpression of multidrug transporters at the blood-brain barrier (BBB) in the epileptic focus is responsible for enhanced efflux of AEDs. Therefore, AEDs cannot reach effective concentrations in epileptogenic brain regions. In animal models, coherence between the increased expression of P-glycoprotein (Pgp) due to seizures and the enhanced release of the excitatory neurotransmitter glutamate could be shown. Glutamate is accepted as a substrate of Pgp. Studies in animals and humans showed that appropriate radiotracers can be used for positron emission tomography (PET) in order to image multidrug transporter function at the BBB. Still, there exist disadvantages for tracers, which can be used in human trials. Therefore, further research is necessary. Eventually, the introduction of PET imaging as clinical diagnostic tool could be suitable to identify patients with parmacoresistant epilepsy, which would benefit from co-administration with Pgp-inhibitors. One object of this thesis was to compare the epileptogenesis between FVB/N wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice in the pilocarpine model. During establishment of the pilocarpine model, the Mdr1a/b(-/-) mice needed significantly less pilocarpine to induce status epilepticus than wildtype animals. Therefore, the brain accumulation of pilocarpine was examined in Mdr1a/b(-/-) , Bcrp1(-/-) , Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-) and wildtype mice. The brain-plasma-ratio was significantly increased in Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-) and wildtype mice, which were pretreated with the Pgp inhibitor tariquidar compared to untreated wildtype animals. Additionally performed concentration equilibrium transport assays (CETAs) and the in vivo results show that Pgp and breast cancer resistance protein (Bcrp) transport pilocarpine. This suggests an influence of Pgp and Bcrp in the pilocarpine model for epilepsy. Furthermore, Mdr1a/b(-/-) and wildtype mice were continuously monitored with electroencephalography (EEG) and video for 43 days. This was done to investigate the hypothesis that Pgp protects neurons in the brain from enhanced glutamate release due to seizures. It was expected that Pgp deficient mice suffer from more severe neurodegeneration and as a consequence develop more frequent seizures than wildtype mice. As result, there existed no obvious differences between wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice in seizure frequency and duration of the latency period. Another aim of this thesis was to compare the phenytoin accumulation in the brain between naïve and chronic epileptic wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice. The brain-plasma-ratios in naïve and epileptic wildtype animals were virtually the same. Therefore it is possible that there was no seizure related overexpression of Pgp in epileptic FVB/N mice. As expected, the brain-plasma-ratios of Mdr1a/b(-/-) mice were significantly increased compared to wildtype mice in the epileptic and also the naïve group. In order to investigate the question if possible PET tracers for imaging of expression and/or function of multidrug transporters at the BBB are also substrates, in vitro transport experiments were performed. Bidirectional transport assays and CETAs with verapamil showed that identification of Pgp substrates depend on the drug concentration used. Unexpectedly, no transport of the phenobarbital N-methyl-derivate mephobarbital was observed, whereas phenobarbital itself is a known Pgp substrate. For this reason, [11C]mephobarbital is not suitable as PET tracer for imaging Pgp function. Also unexpectedly, the accumulation assays resulted in a Pgp and BCRP mediated transport of tariquidar and elacridar in a concentration dependent manner. So far, the Pgp and Bcrp inhibitors tariquidar and elacridar are described as not transported in the literature. PET studies in rodents with [11C]tariquidar and [11C]elacridar as tracers indicate transport of both drugs by Pgp and BCRP. Therefore, the results obtained within this thesis support the in vivo data. Laniquidar was not identified as Pgp or Bcrp substrate. There is a low brain uptake of laniquidar in vivo, so it is possible that there are other active transporters responsible for the laniquidar efflux. In first studies in rodents, the suitability of ciprofloxacin as a PET tracer for imaging of Bcrp function is determined. Therefore, in vitro transport assays with ciprofloxacin were performed. With CETA, transport of ciprofloxacin by Bcrp but not Pgp or MRP1 was observed. In vivo studies showed that Bcrp is probably not the only ciprofloxacin transporter. Therefore, it is possible that other not yet known transport mechanisms exist. The present results provide new insights in the role of Pgp and Bcrp in the pilocarpine model for epilepsy and show that identification of multidrug transporter substrates in vitro depends on selection of adequate assays and drug concentrations.

Epilepsien zählen zu den häufigsten chronisch neurologischen Erkrankungen weltweit. Die Ursachen, welche der Erkrankung zugrunde liegen, können nicht behandelt werden. Daher erfolgt die Therapie symptomatisch und in erste Linie pharmakologisch durch die Applikation von Antiepileptika. Jedoch führt die Pharmakotherapie bei bis zu 75 % der Temporallappenepilepsiepatienten zu keiner anhaltenden Anfallsfreiheit. Eine solche Pharmakoresistenz bei Epilepsien ist noch immer nicht hinreichend verstanden. Eine von mehreren möglichen Hypothesen zur Entstehung der Pharmakoresistenz ist die Multidrug-Transporter-Hypothese, in der von einer erhöhten Expression der Multidrug-Transporter an der Blut-Hirn-Schranke (BHS) im epileptischen Fokus ausgegangen wird. Studien im Tiermodell ergaben einen Zusammenhang zwischen der anfallsbedingten Hochregulation von P Glykoprotein (Pgp) und der erhöhten Ausschüttung des exzitatorisch wirkenden Neurotransmitters Glutamat. Pgp transportiert nicht nur Glutamat, sondern auch einige gebräuchliche Antiepileptika wie Phenytoin oder Phenobarbital. Diverse Studien an Tier und Mensch zeigten, dass durch den Einsatz geeigneter Radiotracer mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) die Funktion von Multidrug-Transportern an der BHS dargestellt werden kann. Die derzeit für Studien im Menschen zur Verfügung stehenden Tracer sind noch mit Nachteilen behaftet, weshalb weiterer Forschungsbedarf besteht. Letztendlich könnte der Einsatz von PET in der klinischen Diagnostik eine Identifikation von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten ermöglichen, denen durch die Ko-Administration von Pgp-Inhibitoren geholfen werden könnte. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Epileptogenese im Pilocarpin-Modell für FVB/N-Wildtyp- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu vergleichen. Hierfür wurde zunächst das fraktionierte Pilocarpin-Modell für die FVB/N-Maus etabliert. Dabei benötigten die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse signifikant weniger Pilocarpin zur Induktion des Status epilepticus (SE) als die Wildtyp-Tiere. Daher schloss sich eine Untersuchung der Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn von Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)-, Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)- und Wildtyp-Mäusen an. Die Gehirn-Plasma-Ratio war in den Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen und einer Teil-Gruppe von Wildtyp-Tieren, welche mit dem Pgp-Inhibitor Tariquidar vorbehandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Wildtyp-Tieren signifikant erhöht. Ergänzend dazu wurden In-vitro-Konzentrations-Gleichgewichts-Transport-Assays (CETAs) durchgeführt. Dadurch wurde gezeigt, dass sowohl Pgp als auch das Breast Cancer Resistance Protein (Bcrp) Pilocarpin transportieren und dadurch einen Einfluss auf das Pilocarpin-Modell haben können. Des Weiteren wurden Mdr1a/b(-/-)- und Wildtyp-Mäuse nach einem Pilocarpin-induzierten SE über einen Zeitraum von 43 Tagen kontinuierlich mittels Elektroenzephalographie (EEG) und Video überwacht. Dies diente der Untersuchung der Hypothese, dass Pgp die Neurone im Gehirn vor der anfallsbedingt erhöhten Glutamat-Ausschüttung schützt und somit Pgp-defiziente Mäuse eine ausgeprägtere Neurodegenration erleiden und dadurch häufigere Anfälle zeigen. Entgegen der Erwartungen waren beim Vergleich der Anfallshäufigkeit und der Dauer der Latenzzeit keine offensichtlichen Unterschiede feststellbar. Ein weiteres Ziel bestand darin, die Phenytoin-Akkumulation im Gehirn zwischen naiven und chronisch epileptischen Wildtyp- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu vergleichen. Es ist wahrscheinlich, dass in den chronisch epileptischen FVB/N-Mäusen keine anfallsbedingte Pgp-Überexpression auftrat, da im Vergleich zu naiven Tieren keine Unterschiede in der Gehirn-Plasma-Ratio bestanden. Die naiven und epileptischen Mdr1a/b(-/-)-Mäuse nahmen signifikant mehr Phenytoin in das Gehirn auf als die Wildtyp-Tiere. Zur Klärung, ob mögliche PET-Tracer zu Darstellung und/oder Funktion von Multidrug-Transportern an der BHS Substrate dieser Transporter sind, wurden In-vitro-Transportstudien durchgeführt. Bidirektionale Transport-Assays sowie CETAs mit Verapamil führten zu dem Ergebnis, dass die Identifikation von Pgp-Substraten von der eingesetzten Substanz-Konzentration abhängt. Ein unerwartetes Ergebnis war, dass das N-Methyl-Derivat von Phenobarbital, das Mephobarbital, nicht durch Pgp transportiert wird, wohingegen Phenobarbital ein nachgewiesenes Pgp-Substrat ist. Dies macht [11C]-Mephobarbital als PET-Tracer zur Darstellung der Pgp-Funktion an der BHS ungeeignet. Ebenfalls unerwartet wurde mittels In-vitro-Akkumulations-Assays konzentrationsabhängiger Transport von Tariquidar sowie Elacridar durch Pgp und Bcrp gefunden. In der Literatur werden die Pgp- und Bcrp-Inhibitoren Tariquidar und Elacridar bisher als nicht-transportiert beschrieben. Durch den Einsatz von [11C]-Tariquidar und [11C]-Elacridar als PET-Tracer im Nager deutete sich an, dass die Inhibitoren durch Pgp und Bcrp transportiert werden könnten. Daher unterstützten die Resultate der vorliegenden Arbeit die In-vivo-Daten. Laniquidar wurde weder als Pgp- noch als Bcrp-Substrat identifiziert. Da in-vivo nur eine geringe Gehirn-Akkumulation von Laniquidar besteht, sind wahrscheinlich andere aktive Transporter für den Efflux verantwortlich. Transport-Experimente mit Ciprofloxacin wurden durchgeführt, da [11C]-Ciprofloxacin in ersten Studien am Nager als PET-Tracer für die Darstellung von Bcrp-Funktion an der BHS getestet wird. Mittels CETA wurde Ciprofloxacin-Transport durch Bcrp, nicht aber durch Pgp und MRP1 nachgewiesen. Aus In-vivo-Studien geht hervor, dass Bcrp vermutlich nicht der einzige Ciprofloxacin-Transporter ist, daher könnten andere, noch unbekannte Transportmechanismen vorhanden sein. Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse zur Rolle von Pgp und Bcrp im Pilocarpin-Modell für Epilepsie und zeigt auf, dass eine Identifikation von Multidrug-Transporter-Substraten in-vitro von der Wahl geeigneter Methoden und Substanzkonzentrationen abhängig ist. 

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Römermann, Kerstin: Die Rolle von Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke im In-vivo-Pilocarpin-Maus-Modell für Epilepsie und In-vitro-Transportuntersuchungen zu potenziellen PET-Tracern. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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