Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems

Schindewolffs, Lia

An effective transport of body fluids is only guaranteed by a functional lymphatic system. Within the context of an axillary dissection during breast cancer treatment this balance can be disturbed, resulting in a secondary lymphedema in about 30% of the patients. The therapy of secondary lymphedema is only symptomatical so far. As a possible surgical therapy, fragments of autologous lymph nodes had been transplanted to prevent lymphedema in rats. VEGF-C showed a beneficial effect in this context. The VEGF-C application pattern with regards to the parameters “time point”, “location” and “dosage” remained unexplored. The aim of this study was to verify these parameters and determine their effects on the regeneration and reconnection of the transplants by using this rat model. In addition, the effects of an extended recovery period (8 weeks) on the regeneration of the transplants were also investigated. During the studies the surgical technique of this rat model caused difficulties regarding the transplant removal. The transplants got attached to the node of the suture, thus the sampling was only manageable with a loss of transplant substance. Therefore, the secondary aim consisted in altering the technique so that a removal without any loss of the substance is possible. Ninety-six adult, healthy female Lewis rats (approximately 200g) underwent surgery, in which all right popliteal and inguinal lymph nodes were removed. Three inguinal lymph nodes of each rat were fragmented and transplanted back into the subcutaneous fat tissue of their right groin by using the modified surgical procedure in which an attachment of the transplants to the node was avoided. The rats in group A (10 rats) were injected with 6.67µg VEGF-C per rat intradermally into the right abdominal wall close to the transplantation area on day 1, 2, 3 post OP. All animals in group B (19 rats) were given 6.67µg VEGF-C per rat intradermally in the medial side of the right thigh on day 1, 2, 3 post OP. In group C all rats (20) were injected with the same dosage of VEGF-C and at the same location as group B, but on day 14, 15, 16 post OP. The rats in group D (20 rats) were injected 13.34µg VEGF-C per rat on the same time points and location as group B. In group E (20 rats) there was no further intervention after surgery, likewise in the pilot group (7 rats). After 4 weeks (group A-E) or 8 weeks (pilot group) the lymphatic drainage and the connection of lymphatic vessels with the transplants were tested. Therefore, Patent Blue was injected intradermally into the medial side of the right thigh. The distribution of the dye was examined and graded as “rat with transplant reconnection” or “rat without transplant reconnection”. Afterwards the transplants were prepared for HE staining (pilot group, group A-E) and immunohistochemistry (group A-E) to detect T-lymphocytes, B-lymphocytes, HEVs and lymphatic endothelial cells. The rats were graded as “rat with regenerated transplants” or “rat without regenerated transplants” due to the cell distribution detected by fluorescent immunohistochemistry. Pilot Study: After a recovery period of 8 weeks 4 out of 7 (57%) rats showed possibly regenerated lymph nodes. In group E 14 out of 20 (70%) of the animals revealed regenerated lymph nodes after a recovery period of 4 weeks. Surgery modification: The removed transplants showed no attachment to the node of the suture and in only 2 of the rats (2%) were the transplants found in the close surrounding of the transplantation area; they did not remain fixed to the non-absorbable suture. Transplant reconnection with the lymphatic system: In group A 5 out of 10 rats (50%) showed a reconnection of the transplants with the lymphatic system. In group B 10 out of 19 rats (53%) and in group C 7 out of 20 rats (35%) had a reconnection of the transplants. In group D there were 17 out of 20 rats (85%) with a detectable transplant reconnection. The control group (group E) showed a reconnection in only 3 out of 20 rats (15%). Transplant regeneration: In group A 8 out of 10 rats (80%) and in group B 17 out of 19 rats (89%) showed regenerated lymph nodes. In group C there were 17 out of 20 rats (85%) with a successful regeneration of the transplants and in group D there were 18 out of 19 rats (95%). The control group (group E) showed 14 out of 20 rats (70%) with regenerated lymph nodes. This work shows that an avascular transplantation of autologous lymph node fragments is possible and that an extended recovery period does not result in better regeneration rates. A change in the surgical procedure leads to an easier sampling while avoiding loss of substance. Furthermore, VEGF-C enhances the regeneration of the transplants and the reconnection of lymph node fragments with the lymphatic system. An early time point on days 1, 2 and 3 post OP and the intradermal injection into the medial side of the thigh especially improve the reconnection of the transplants with the lymphatic system. The modifications in both of the parameters do not affect the regeneration of the transplants statistically. Only the dosage shows an effect on the transplant reconnection as well as the transplant regeneration. A dosage of 13.34 µg VEGF-C revealed a statistical tendency to improve regeneration; it also enhances the reconnection extremely significantly. This study confirms that the avascular transplantation of autologous lymph node fragments is a possible therapy for secondary lymphedema, especially with respect to the prevention after breast cancer treatment.

Ein effektiver Transport von Körperflüssigkeiten ist nur durch ein funktionstüchtiges Lymphsystem zu gewährleisten. Nach einer Entfernung der Lymphknoten in der Axilla im Rahmen einer Brustkrebstherapie kann das Gleichgewicht aus anfallender Lymphflüssigkeit und dem Abtransport dieser gestört sein. Dies resultiert in einem sekundären Lymphödem bei etwa 30% der Patientinnen. Die Therapie für das sekundäre Lymphödem ist bisher rein symptomorientiert. Ein chirurgischer Therapieansatz ist die avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente. Diese wurde in der Vergangenheit zur Prävention eines sekundären Lymphödems an der Ratte erforscht. Dabei konnte ein positiver Effekt von VEGF-C festgestellt werden. Die VEGF-C-Applikations-Parameter „Zeitpunkt“, „Lokalisation“ und „Dosis“ waren bislang jedoch nicht untersucht worden. Das Ziel der Arbeit war es, die Grundlagen und Methoden dieses Ratten-Modells aufzugreifen und zu verbessern, indem die Applikations-Parameter auf ihre Einflüsse auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate untersucht wurden. Außerdem wurden die Effekte einer längeren Ruhephase von 8 Wochen auf die Regeneration der Transplantate wurden in Form einer Vorversuchsgruppe erforscht. Die Operationstechnik des Ratten-Modells verursachte allerdings Probleme bei der Entnahme der Transplantate. In den meisten Fällen verwuchsen diese während der Ruhephase mit dem Knoten des Nahtmaterials, so dass ihre Entfernung nur unter Substanzverlusten möglich wurde. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand somit darin, die chirurgische Technik dahingehend zu modifizieren, dass eine substanzverlustfreie Entnahme der Transplantate durchgeführt werden kann. Sechsundneunzig adulten, gesunden, weiblichen Lewis Ratten (durchschnittliches Gewicht: 200g) wurden alle poplitealen und inguinalen Lymphknoten der rechten Körperhälfte entfernt. Drei der inguinalen Lymphknoten wurden fragmentiert und subkutan zurück in die rechte Leiste transplantiert. Dabei wurde die Operationstechnik dahingehend modifiziert, dass eine Verwachsung der Transplantate mit dem Knoten verhindert wird. Gruppe A (n=10) erhielt eine intradermale Injektion von 6,67 µg VEGF-C pro Ratte an den Tagen 1, 2 und 3 post OP in Bauchwand nahe des Transplantationsgebietes. Die Tiere in Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C zum gleichen Zeitpunkt wie die Gruppe A, allerdings erfolgte die Injektion intrakutan in die mediale Seite des rechten Oberschenkels. In der Gruppe C (n=20) wurden die Ratten wie die in Gruppe A behandelt, erhielten VEGF-C jedoch an den Tagen 14, 15 und 16 post OP. Auch in Gruppe D (n=20) wurden die gleichen Parameter wie in der Gruppe A gewählt, allerdings wurde die Dosis auf 13,34 µg VEGF-C verdoppelt. Die Gruppe E (n=20) fungierte als Kontrollgruppe und erhielt keine VEGF-C-Applikation. Die Tiere in der Vorversuchsgruppe (n=7) bekamen wie die in der Kontrollgruppe auch kein VEGF-C. Nach entweder 4 (Gruppe A-E) oder 8 (Vorversuchsgruppe) Wochen Ruhephase wurde die Verbindung der Transplantate mit dem Lymphsystem und die Lymphdrainage-Fähigkeit der Transplantate überprüft. Zu diesem Zweck wurde Patent Blau intrakutan in den ipsilateralen Oberschenkel injiziert. Die Verteilung des Farbstoffes wurde anschließend überprüft und die Tiere wurden in „Ratte mit Transplantat-Wiederanschluss“ und „Ratte ohne Transplantat-Wiederanschluss“ eingestuft. Anschließend wurden die Transplantate entnommen und es erfolgte eine HE-Färbung (Vorversuchsgruppe, Gruppe A-E) und eine immunhistochemische Färbung (Gruppe A-E), um die Regenerate auf ihre physiologische Verteilung von B- und T-Lymphozyten, HEVs und Lymphendothelzellen zu überprüfen. Die Tiere wurden nach der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung ihrer Transplantate in „Ratte mit regenerierten Transplantaten“ oder „Ratte ohne regenerierte Transplantate“ eingestuft. Vorversuch: Nach einer achtwöchigen Ruhephase waren bei 4 von 7 Tieren (57%) potentiell regenerierte Transplantate festzustellen. In der Kontrollgruppe, in der die Tiere 4 Wochen Ruhephase hatten, waren nach der Immunhistochemie bei 14 von 20 Tieren (70%) regenerierte Transplantate vorhanden. Chirurgische Modifikation: Bei keiner der Ratten kam es zu Verwachsungen der Transplantate mit dem Knoten des Nahtmaterials und bei nur 2 der Ratten (2%) waren die Transplantate bei der Entnahme nicht mehr am Nahtmaterial, sondern in der nahen Umgebung des Transplantationsgebietes aufzufinden. Transplantat-Wiederanschluss mit dem Lymphsystem: In der Gruppe A konnte bei 5 von 10 Tieren (50%) ein Wiederanschluss beobachtet werden. In der Gruppe B waren es 10 von 19 (53%) und in der Gruppe C 7 von 20 (35%) Tieren. Die Gruppe D wies 17 von 20 Tieren (85%) mit einem Wiederanschluss an das Lymphsystem auf; die Gruppe E nur 3 von 20 Tieren (15%). Regeneration der Transplantate: In der Gruppe A konnten bei 8 von 10 Tieren (80%) regenerierte Transplantate festgestellt werden; in der Gruppe B waren es 17 von 19 Tieren (89%). Bei der Gruppe C wiesen 17 von 20 Tieren (85%) regenerierte Lymphknotenfragmente auf und bei der Gruppe D waren es 18 von 19 Tieren (95%). In der Kontrollgruppe (Gruppe E) konnten dagegen nur 14 von 20 Ratten (70%) mit regenerierten Transplantaten gefunden werden. Die hier vorliegende Dissertation hat bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente möglich ist und sich eine verlängerte Ruhephase von 8 Wochen nicht in besseren Regenerations-Raten der Transplantate widerspiegelt. Eine Modifikation der Operationstechnik hat sich als sinnvoll erwiesen und führt zu einer leichten Entnahme der Transplantate ohne Substanzverlust. Darüber hinaus wurde eindrucksvoll gezeigt, dass sich die VEGF-C-Applikations-Parameter unterschiedlich auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate auswirken und VEGF-C diese beiden Untersuchungs-Fokusse generell fördert. Ein früher Zeitpunkt an den Tagen 1, 2 und 3 post OP sowie die intradermale Injektion von VEGF-C in die mediale Oberschenkelseite stimulieren den Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem. Eine Förderung der Regeneration konnte in diesem Zusammenhang statistisch jedoch nicht erwiesen werden. Nur die Dosis wirkt sich sowohl auf den Wiederanschluss als auch auf die Regeneration der Transplantate statistisch relevant aus. Eine Dosis von 13,34 µg fördert eine Regeneration statistisch tendenziell und einen Wiederanschluss statistisch höchst signifikant. Diese Dissertation bestätigt, dass eine avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente eine mögliche Therapie für das sekundäre Lymphödem ist. Insbesondere in Form einer präventiven chirurgischen Maßnahme könnte diese Methode in Zukunft bedeutsam sein.

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Schindewolffs, Lia: Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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