Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular biological and biophysical structure-function analyses of Connexin46

Schlingmann, Barbara Lisa

In mammals, mature lens cells, lens fiber express two connexin isoforms: Cx50 (human hCx50, rat rCx50, chicken cCx45.6 and bovine bCx44) and Cx46 (human hCx46 and rat rCx46, chicken cCx56 and bovine bCx44). Between lens fibers, connexins form gap junction channelsthat participate in the lens transport system, which provides a constant flow of nutrients for maintaining lens survival and lens transparencyof the avascular lens Since, the cellular function of a specific protein is determined by its three dimensional structure, which is dicated by its respective primary structure, the aim of this thesis was, to characterize the structure function relationship of Cx46 by using two different expression systems, Xenopus oocytes and the HeLa cells. The first part of this thesis focuses on rCx46. Previous two-electrode voltage-clamp studies showed that truncation after H243 (rCx4628.2) altered the formation of functional hemichannels when expressed in Xenopus oocytes. In contrast the mutant rCx4637.7, truncated after A333, formed hemichannels similarly to rCx46wt, whose C-terminus (CT) contain 186 residues (H230‑I416). This indicates that the C-terminal region up to A333 is involved in functional expression of rCx46. To analyze the role of the CT up to A333 in functional expression, new mutants were generated by C-terminal truncation between H243‑A333, labeled with EGFP and expressed in HeLa cells. Confocal laser scanning microscopy and dye transfer experiments were performed to study the expression behavior of the rCx46 variants according to their compartmentalization in organelles, their presence in vesicles and their ability to form functional gap junction plaques. Quantification of expression behavior revealed that the C-terminal region up to A311 (rCx4635.3) is necessary for an expression behavior like the rCx46wt, that was compartmentalized, found in vesicles, and form functional gap junction plaques, while the mutant rCx4628.2 was not able to form functional gap junction plaques, was neither compartmentalized nor found in vesicles. .The mutant rCx4632.6 truncated after P284 was not compartmentalized and was rarely found in vesicles. However, rCx4632.6 formed functional gap junction plaques, indicating that this protein was transported to the membrane. Live-cell imaging and detection of annular junctions for rCx4632.6 and rCx4635.3 revealed that the truncation after P284 reduced the frequency of vesicle budding from gap junction plaques, as well as the formation of annular junctions. These results suggest that the H230‑P284 C-terminal region (rCx4632.6) is necessary for the formation of dye coupled gap junction channels. Additionally, the C-terminal region of rCx46 up to A311 (rCx4635.3) contains all structural elements that are necessary for its correct compartmentalization and internalization in form of annular junctions. In the second part the role of N-terminus (NT) in voltage-dependent regulation of Cx46 gap junction channels was analyzed. For Cx26 and Cx37 it was shown that the N-termini of connexins form a pore funnel as channel entrance. Charged amino acid residues in the NT of the respective connexin are suggested to be important for the structure and for the voltage sensitivity of the gap junction channels. A cataract-associated mutation at the third position (D3Y) within the NT of hCx46 was used as model to elucidate the role of the NT in expression and function of Cx46. Expression of EGFP-labeled hCx46wt and hCx46D3Y in HeLa cells revealed that the mutation did not affect the formation of gap junction plaques. Dye transfer experiments, using Lucifer Yellow (LY) and ethidium bromide (EthBr) revealed a significantly higher degree of dye coupling for hCx46D3Y compared to the wild type. In Xenopus oocytes, two-electrode voltage-clamp experiments showed that hCx46wt formed voltage-sensitive hemichannels, while this was not found for the oocytes expressing hCx46D3Y. The reintroduction of a negatively charged residue, glutamic acid, at the third position generating the mutant hCx46D3E, restored the voltage sensitivity of the resultant hemichannels in oocytes. Moreover, HeLa cell pairs expressing hCx46D3E and hCx46wt showed a similar degree of dye coupling. These results indicate that the negatively charged aspartic acid residue at the third position of the NT of hCx46 could be involved in the determination of the degree of metabolite cell-to-cell coupling and is essential for the voltage sensitivity of the hCx46 hemichannels. In conclusion, it was shown that functionality of Cx46 gap junctions can be regulated by their structure. Not only whole domains affect functionality, as shown for the CT of rCx46; but also single amino acid residues such as the D3 for hCx46 can regulate the function of the protein

Linsenfaserzellen von Säugetieren exprimieren zwei verschiedene Connexin-Isoformen: Cx50 (Orthologe: Human hCx50, Ratte rCx50, Huhn cCx45.6 und Rind bCx49) und Cx46 (Orthologe: Human hCx46, Ratte rCx46, Huhn cCx56 und Rind bCx44). Diese Connexine bilden Gap Junction Kanäle zwischen Linsenfaserzellen und sind in der avaskulären Linse von besonderer Bedeutung. Sie sind Teil eines Transportsystems, welches einen konstanten Fluss von Nährstoffen innerhalb der Linse ermöglicht und so für das Überleben der Linsenfasern und für die Aufrechterhaltung der Linsentransparenz sorgt. Da die Funktion eines Proteins von seiner dreidimensionalen Struktur abhängt ist, welche wiederum von der Aminosäuresequenz determiniert wird, war es Ziel dieser Arbeit die Struktur-Funktionsbeziehung von Cx46 mittels Nutzung von zwei verschiedenen Expressionssystemen, HeLa Zellen und Xenopus Oozyten, zu charakterisieren. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit rCx46. Frühere Two-electrode voltage-clamp Experimente zeigten das eine Trunkierung des C-Terminus (CT) bei der Aminosäure H243 (rCx4628.2) die Bildung funktioneller Halbkanäle in Xenopus Oozyten reduziert. Wohingegen Oozyten, die die Mutante rCx4637.7, welche bei der Aminosäure A333 trunkiert wurde, exprimieren, ein Verhalten wie das des Wildtyps zeigen, dessen CT von Aminosäure H230 bis I416 reicht. Diese Resultate führten zu der Annahme, dass der CT bis zu der Aminosäure A333 eine essentielle Rolle bei der funktionellen Expression von rCx46 spielen könnte. Um die Rolle des CT bei der funktionellen Expression zu untersuchen, wurden neue Mutanten durch Trunkierung des CT in der Region H243-A333 generiert, welche dann mit EGFP markiert und in HeLa Zellen exprimiert wurden. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie und Farbstofftransferexperimente wurden durchgeführt, um die funktionelle Expression zu untersuchen. Dabei wurden die Kompartimentierung, die Bildung mikroskopisch detektierbarer Vesikel und die Bildung funktioneller Gap Junction Plaques analysiert. Eine Quantifizierung dieses Verhaltens ergab, dass die Mutante rCx4635.3, welche bei der Aminosäure A311 trunkiert wurde, ein Expressionsverhalten wie der Wildtyp zeigt. HeLa Zellen, welche diese rCx46 Varianten exprimieren zeigten eine distinkte Kompartimentierung in ER und Golgi Apparat. Es konnten mikroskopisch detektierbare Vesikel beobachtet werden. Funktionelle Gap Junction Plaques wurden durch Farbstofftransferexperimente ebenfalls nachgewiesen. Für die Mutante rCx4628.2 konnten in HeLa Zellen keine funktionellen Gap Junction Plaques nachgewiesen werden. Zudem war keine Kompartimentierung oder Vesikelbildung zu beobachten. Die Mutante rCx4632.6, mit einem CT von H230-P284, zeigte ebenfalls keine Kompartimentierung und sowie einer reduzierten Vesikelbildung. Allerdings bildete diese Mutante funktionelle Gap Junction Plaques was zeigt, dass das Protein trotz der reduzierten Vesikelbildung und der fehlenden Kompartimentierung zur Membran transportiert wurde. Life-cell imaging Experimente und die Quantifizierung von Annular Junction mit rCx4632.6 und rCx4635.3 zeigten zudem das eine Trunkierung des CT auch die Internalisierung des Proteins beeinflusst. Die Vesikelabgangsrate aus Gap Junction Plaques ebenso wie die Anzahl an Annular Junctions war bei rCx4632.6 deutlich reduziert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde geschlossen, dass die C-terminale Region H230-P284 notwendig für die Bildung funktioneller Gap junction Plaques ist. Ein CT bis zu der Aminosäure A311 besitzt jedoch alle strukturellen Elemente für eine adäquate Kompartimentierung und Internalisierung in Form von Annular junctions für rCx46. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden der N-Terminus (NT) und seine Rolle in der spannungsabhängigen Regulation von Cx46 Gap Junction Kanälen untersucht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die N-termini von Connexinen innerhalb der Kanalpore liegen und eine trichterartige Struktur innerhalb des Kanaleinganges ausbilden. Geladene Aminosäurereste sollen dabei eine Rolle zur Stabilisierung dieser Struktur, aber auch bei der Spannungssensitivität spielen. Um die Rolle des NT bei der funktionellen Expression und Regulation der Funktion von Cx46 Kanälen zu untersuchen, wurde eine Katarakt-assoziierte Mutation, welche einen Austausch der dritten Aminosäure von Aspartat zu Tyrosin im humanen Cx46 zur Folge hat, genutzt. Durch die Expression von EGFP-markierten hCx46 und hCx46D3Y konnte gezeigt werden, dass die Mutation keinen Einfluss auf die funktionelle Expression hat. Farbstofftransferexperimente mit Lucifer Yellow und Ethidiumbromid zeigten, dass die gebildeten Gap Junction Plaques funktionelle Kanäle beinhalten. HeLa Zellen, welche hCx46D3Y exprimierten, zeigten sogar eine erhöhte Permeabilität für die Farbstoffe im Vergleich zum Wildtyp. Two-electrode voltage-clamp Experimente mit Xenopus Oozyten zeigten, dass hCx46 spanungssensitive Halbkanäle ausbildet, während für Ooyzten, welche hCx46D3Y exprimieren keine spannungssensitiven Kanäle detektiert werden konnten. Ein Aminosäureaustausch mit einer ebenfalls negativ geladenen Aminosäure, Glutamat (hCx46D3E), führte dazu, dass wieder spannungssensitive Kanäle gebildet wurden. Auch die Farbstofftransferexperimente mit hCx46D3E zeigten eine Kopplung der Zellen wie beim Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass die negative Ladung an Position drei im NT von hCx46 wichtig für die Spannungssensitivität ist und auch eine Rolle bei der Selektivität von verschiedenen Metaboliten sein kann. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Funktionalität von Cx46 Gap Junction Kanälen durch ihre Funktion determiniert ist. Dabei wurde nachgewiesen, dass ganze Domänen wie z.B. der CT für die Regulation der Funktion wichtig sind, aber auch einzelne Aminosäuren, wie D3 im NT von Cx46

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Schlingmann, Barbara Lisa: Molecular biological and biophysical structure-function analyses of Connexin46. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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