Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

PSMA, a marker for prostate cancer: Molecular signalling and transport mechanisms in humans and their transferability to dogs

Schmidt, Sonja

Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a type-II-transmembrane-glycoprotein with folate hydrolase and carboxypeptidase activity. PSMA is mainly expressed in epithelial cells of the prostate and elevated levels of PSMA are detected in prostate cancer cells including those that are metastatic, and in neovasculature of further tumours. Thereby levels of PSMA are directly proportional to disease grade and stage. It is therefore a promising biomarker in the diagnosis of prostate cancer and a potential target for antibody-based therapeutic strategies in men. PSMA is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) and transported via different DRMs along the secretory pathway. In this study we addressed the role of DRMs or lipid rafts in two major physiological events that are of pivotal importance in the life cycle of PSMA, homodimerization and internalization. The mature and homodimeric forms of PSMA are mainly insoluble in Lubrol WX, but do not associate with Triton X-100-DRMs. Antibody-induced cross-linking of PSMA leads to increased internalization of PSMA, activation of different signalling cascades like the MAPK-pathway, redistribution of PSMA to Triton X-100-DRMs in a time-dependent manner as well as alterations in the expression levels of several proteins in these DRMs. One of the proteins also clustering in Triton X-100-DRMs is α-tubulin, and this study shows that PSMA is internalized via microtubules. Another protein showing a trend of downregulation in Triton X-100-DRMs upon activation of PSMA is laminin receptor-1 (67LR). Indirect immunofluorescence and co-immunoprecipitation experiments revealed a direct interaction between 67LR and YFP-PSMA. This interaction might be of particular interest, because 67LR plays an important role in cell adhesion to the basement membrane and less expression of 67LR within microdomains of the cell surface might be associated with an increased risk of metastasis. Taken together, the results strongly propose an essential role for different types of membrane microdomains in homodimerization, internalization and signalling pathways involving PSMA. As a potential target for animal preclinical studies of antibody based-therapies, the canine PSMA protein was identified and investigated regarding its cellular distribution and the biochemical characteristics in either COS-1 cells or MDCK cells. It appears that the canine and human PSMA proteins share many biochemical and cellular characteristics. Canine PSMA shows 91% amino acid homology to human PSMA, whereas the major difference is a longer cytoplasmic tail of canine PSMA compared to its human counterpart. In addition to an equal distribution to cellular compartments, similar glycosylation pattern and a slightly more rapid trafficking pattern were revealed. In a fashion almost similar to human PSMA, canine PSMA also forms homodimers and is associated with distinct lipid microdomains. Therefore human and canine PSMA are very similar in their behaviour and canine PSMA turned out to be a useful model-protein for prostate cancer and suitable antigen for targeted therapy studies in dogs.

Das Prostata-spezifische Membran Antigen (PSMA) ist ein Typ-II-Transmembranprotein mit Folathydrolase- und Carboxypeptidase-Aktivität. PSMA wird überwiegend in den Epithelzellen der Prostata exprimiert, wobei die Expression in Prostatakrebszellen, deren Metastasen und auch Blutgefäßen zahlreicher anderer Tumorarten proportional zum Schweregrad der Erkrankung erhöht ist. Deshalb handelt es sich hierbei um ein vielversprechendes Markerprotein, das für die Prostatakrebs-Diagnose sowie für verschiedene Immuntherapien beim menschlichen Prostatakarzinom herangezogen werden kann. Im Zuge seiner Biosynthese wird PSMA entlang des sekretorischen Transportweges in unterschiedlichen Membranmikrodomänen transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Funktion der Membranmikrodomänen während der Homodimerisierung und Endozytose von PSMA untersucht werden. Die reife, homodimere Form von PSMA ist mit Lubrol WX-resistenten Membranmikrodomänen assoziiert, nicht aber mit Triton X-100-resistenten Membranen. Cross-linking von oberflächlichen PSMA-Molekülen mit Hilfe spezifischer Antikörper führt zu einer erhöhten Endozytose-Rate des Proteins, zur Aktivierung verschiedener Signalkaskaden wie dem MAPK-Signalweg, zu einer Umverteilung von PSMA in Triton X-100-resistente Membranmikrodomänen und gleichzeitig zu einer veränderten Expression anderer Proteine in diesen Triton X-100-resistenten Membranen. α-tubulin wird aufgrund der Aktivierung von PSMA ebenfalls in Triton X-100-resistente Membranmikrodomänen umsortiert und diese Studie ergab, dass die Endozytose von PSMA entlang der Mikrotubulie stattfindet. Der Laminin Rezeptor-1 (67LR) ist nach der Aktivierung von PSMA weniger stark mit den Triton X-100-resistenten Membranen assoziiert. Indirekte Immunfluoreszenz und Co-Immunpräzipitation zeigten eine direkte Interaktion zwischen 67LR und YFP-PSMA. Da 67LR eine wichtige Rolle bei der Zelladhaesion spielt, könnte eine verminderte Expression in den Membranmikrodomänen der Zellmembran ein erhöhtes Risiko für Krebsmetastasen darstellen. Diese Ergebnisse demonstrieren die Wichtigkeit verschiedener Membranmikrodomänen bei der Homodimerisierung, Endozytose und den Signalwegen von PSMA. Da auf PSMA basierende Therapien auch in vorklinischen Studien am Tier getestet werden müssen, wurde als mögliches Modell das Hunde-PSMA-Protein identifiziert um dessen zelluläre Verteilung und die biochemischen Charakteristika in COS-1-Zellen und MDCK-Zellen zu untersuchen. Hierbei zeigten sich viele identische biochemische und zelluläre Eigenschaften. Die Aminosäure-Sequenz vom Hunde-PSMA ist zu 91% homolog zu der entsprechenden Sequenz des Menschen, wobei der größte Unterschied zwischen beiden ein längerer cytoplasmatischer Teil des Hunde-PSMA ist. Genauso wie die Verteilung beider Proteine zwischen den verschiedenen zellulären Kompartimenten, ist auch die Glykosylierung beider Proteine ähnlich. Der Transport vom Hunde-PSMA zwischen dem ER und dem Golgi-Apparat findet etwas schneller statt, verglichen mit der Transportrate des humanen Proteins. Sowohl die Homodimerisierung als auch die Assoziation mit verschiedenen Membranmikrodomänen ist bei den PSMA-Proteinen beider Spezies vergleichbar. Da PSMA von Mensch und Hund sehr ähnliche Charakteristika aufweisen, hat diese Studie gezeigt, dass Hunde-PSMA ein geeignetes Modell-Protein für die menschliche Prostata und ein geeignetes Ziel-Antigen für auf PSMA basierende Therapien darstellt.

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Schmidt, Sonja: PSMA, a marker for prostate cancer: Molecular signalling and transport mechanisms in humans and their transferability to dogs. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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