Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effects of cladribine on primary rat microglia and human monocyte-derived dendritic cells

Singh, Vikramjeet

2-chlorodeoxyadenosine (cladribine, CdA) is an immunosuppressive drug that is toxic to lymphocytes and has been widely used in the treatment of several types of leukemia. Depletion of lymphocytes leads to a transient immune suppression and this property of CdA has been employed as a therapy for some autoimmune disorders such as rheumatoid arthritis and autoimmune hemolytic anemia. Recently, CdA has been also tested for its therapeutic efficacy in multiple sclerosis (MS) patients and shown to have a favorable effect on disease progression. Despite of an enormous knowledge relating to its effects on leukocytes, it is still poorly understood if CdA can affect the tissue residing macrophages such as microglia and dendritic cells (DC). Microglia are the major immune cells of the CNS and are known to have an important role in the pathogenesis of MS. On one hand activated microglia can cause CNS tissue damage through the release of proinflammatory mediators while on the other hand they can reactivate infiltrating T-cells via presentation of myelin antigens. It is noteworthy that CNS antigen specific T-cells that can cause damage to the neural tissue are primed in the periphery. DC are the best known antigen presenting cells that have the unique ability to prime naive T-cells. Usually antigen presentation and T-cell priming is a tightly regulated process and often directed against foreign antigens. At times T-cells are primed against self-antigens and this can lead to autoimmunity as in the case of MS. Therefore, dendritic cells and T-cell priming forms a logical check point for controlling autoimmune diseases. The aim of this study was to investigate the effects of CdA on primary rat microglia in vitro and on ex vivo generated human monocyte-derived DC. We showed that CdA inhibits microglia proliferation and induces apoptosis through an intrinsic mitochondrial pathway. The inhibition of proliferation was observed at early time points followed by the activation of caspase-3 and -9 whereas PS externalization, reduction in mitochondrial potential, and DNA fragmentation were evident at later time points. CdA treatment did not induce activation of autophagic protein LC3B suggesting that delayed apoptosis in microglia was not due to the induction of autophagy. We also found that non-toxic concentrations of CdA did not affect the phagocytic capacity and LPS-induced release of TNF-α and nitric oxide (NO) in microglia, suggesting that the effect of CdA on microglia is mediated via cytotoxicity but not immune modulation. In our further experiments we studied the effects of CdA on human monocytes and monocyte-derived DC and showed that in monocytes apoptosis was induced at early time points while DC were relatively resistant to CdA treatment and exhibited delayed kinetics of apoptosis. Interestingly, CdA induced apoptosis in monocytes was caspase-dependent and was mediated through an intrinsic mitochondrial pathway. In contrast, caspase activation was not detected in DC suggesting that CdA induced caspase-independent apoptosis in DC. The key features of apoptosis such as PS externalization, reduction in mitochondrial potential and presence of fragmented nuclei were measurable in DC only after 72 h of CdA treatment whereas activation of p53 was observed at early time points. The mRNA and protein expression analysis of deoxycytidine kinase (DCK), a key enzyme that regulates CdA activity within the cells, showed no differences in its levels in monocytes and DC. Based on these findings, we conclude that CdA induces early apoptosis in monocytes; however, these effects are delayed in microglia and monocyte-derived DC. The diverse effects of CdA in different cell types propose the involvement of distinct apoptotic mechanisms. The data also suggest the potential of CdA to limit microglia and DC numbers through inhibition of their proliferation or inducing delayed apoptosis.  Furthermore, CdA can cross the blood-brain-barrier and therefore can affect the CNS resident microglia or infiltrating macrophages. Hence CdA could be effective not only in the early stages of MS but also in the advanced stages where the inflammation is compartmentalized within the CNS.

2-Chlorodeoxyadenosin (Cladribine, CdA) ist ein Immunsuppressivum, das vor allem toxisch auf Lymphozyten wirkt und so in der Behandlung verschiedener Leukämien eine breite Anwendung findet. Die Depletion von Lymphozyten durch CdA führt zu einer vorübergehenden Immunsuppression, so dass CdA auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie der Rheumatoiden Arthritis oder der Autoimmunhämolytischen Anämie Anwendung findet. Außerdem wurde die Wirksamkeit von CdA zur Therapie der schubförmigen und chronisch-progredienten Multiplen Sklerose (MS) in verschiedenen klinischen Studien untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sich die Behandlung mit CdA günstig auf die Krankheitsprogression auswirkt. Obwohl die Effekte von CdA auf Leukozyten bereits sehr gut untersucht wurden, gibt es bisher nur unzureichende Erkenntnisse darüber, ob CdA auch die Funktion von Gewebsmakrophagen wie z.B. Mikroglia oder auch von dendritischen Zellen (DC) beeinflussen kann. Mikroglia stellen die wichtigsten Immunzellen des zentralen Nervensystems  (ZNS) dar und spielen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der MS. Aktivierte Mikroglia können zum einen durch die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren zu einer Gewebeschädigung im ZNS beitragen, zum anderen können sie durch die Präsentation von Antigenen gegen Myelin infiltrierende T-Zellen reaktivieren. Voraussetzung für eine Schädigung des ZNS durch diese antigen-spezifischen T-Zellen ist ihre Prägung in der Peripherie. DC repräsentieren die potentesten Antigen präsentierenden Zellen (APC) in der Peripherie und haben die Fähigkeit T-Zellen zu prägen. Dieser Prozess ist streng reguliert und die T-Zell-Antwort richtet sich in der Regel gegen körperfremde Antigene. Richtet sich die T-Zell-Antwort allerdings gegen körpereigene Proteine kommt es zu einer Autoimmunreaktion. So richtet sich bei der MS die autoimmune T-Zell-Antwort gegen Myelinproteine im ZNS.  Die T-Zellprägung durch DC hat somit eine Schlüsselfunktion bei der Kontrolle von Autoimmunreaktionen.  Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Einflusses von CdA in vitro auf Mikroglia anhand einer primären Rattenzellkultur als auch ex vivo auf humane, aus Monozyten generierten DC. Wir konnten zeigen, dass CdA die Proliferation von Mikroglia hemmt und Apoptose durch einen intrinsischen mitochondrialen Wirkmechanismus induziert. Eine Hemmung der Proliferation fand sich bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt gefolgt von einer Aktivierung von Caspase -3 and -9. Allerdings zeigten sich eine Externalisierung von Phosphatidylserin (PS), Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und eine DNA Fragmentierung erst zu späteren Zeitpunkten. CdA führte allerdings zu keiner Aktivierung von LC3B, ein Protein was bei autophagischen Prozessen eine wichtige Rolle spielt. Es ist somit anzunehmen, dass die verzögerte Apoptose in Mikroglia durch CdA nicht durch die Induktion von Autophagozytose bedingt ist. Darüberhinausgehend konnten wir keinen Einfluss von CdA auf die Phagozytose-Kapazität von Mikroglia oder die Sekretion von LPS-induzierten TNF-α und Stickstoffmonoxid (NO) feststellen. In unseren Experimenten zeigte CdA somit vor allem einen zytotoxischen und keinen immunmodulierenden Effekt auf Mikroglia. Des Weiteren untersuchten wir den Einfluss von CdA auf humanen, aus Monozyten generierten DC.  Obwohl CdA frühzeitig Apoptose in Monozyten induzierte, zeigten sich DC zunächst relativ resistent in Bezug auf die Behandlung mit CdA und erst zu späteren Zeitpunkten kam es zur Apoptose. Interessanterweise war die durch CdA induzierte Apoptose in Monozyten durch die Aktivierung von Caspasen und durch einen intrinsischen mitochondrialen Wirkmechanismus vermittelt. Im Gegensatz dazu fand sich in den DC keine Aktivierung der Caspasen. Schlüsselmechanismen der Apoptose wie die PS Externalisierung, Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und eine DNA Fragmentierung fanden sich erst nach 72 Stunden, wobei wir eine Aktivierung von p53 bereits zu früheren Zeitpunkten feststellen konnten. Es zeigten sich keine Unterschiede der mRNA und Protein Expression der Deoxyzytidin-Kinase (DCK), ein Schlüsselenzym bei der Regulierung der CdA Aktivität innerhalb von Zellen. Zusammenfassend konnten wir feststellen, dass CdA zwar frühzeitig Apoptose in Monozyten auslöst jedoch erst zu späteren Zeitpunkten in Mikroglia und DC. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass innerhalb verschiedener Zelltypen unterschiedliche Apoptosemechanismen eine Rolle spielen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass CdA zu einer Reduktion von Mikroglia und DC durch Hemmung der Proliferation bzw. Induktion von später Apoptose führen kann. Da CdA die Bluthirnschranke überwinden kann, könnten sich diese Effekte auch auf Mikroglia im ZNS und infiltrierende Makrophagen bei MS Patienten auswirken. Diese Effekte von CdA könnten eine Erklärung dafür sein, dass CdA nicht nur bei der schubförmigen MS, sondern auch im progredienten Krankheitsstadium wirksam ist, wo die inflammatorische Immunantwort in der Periphere durch eine Kompartimentierung des Entzündungsprozesses innerhalb des ZNS nur noch eine untergeordnete Rolle spielt. 

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Singh, Vikramjeet: Effects of cladribine on primary rat microglia and human monocyte-derived dendritic cells. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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