Effects of cladribine on primary rat microglia and human monocyte-derived dendritic cells

2-Chlorodeoxyadenosin (Cladribine, CdA) ist ein Immunsuppressivum, das vor allem toxisch auf Lymphozyten wirkt und so in der Behandlung verschiedener Leukämien eine breite Anwendung findet. Die Depletion von Lymphozyten durch CdA führt zu einer vorübergehenden Immunsuppression, so dass CdA auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie der Rheumatoiden Arthritis oder der Autoimmunhämolytischen Anämie Anwendung findet. Außerdem wurde die Wirksamkeit von CdA zur Therapie der schubförmigen und chronisch-progredienten Multiplen Sklerose (MS) in verschiedenen klinischen Studien untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sich die Behandlung mit CdA günstig auf die Krankheitsprogression auswirkt. Obwohl die Effekte von CdA auf Leukozyten bereits sehr gut untersucht wurden, gibt es bisher nur unzureichende Erkenntnisse darüber, ob CdA auch die Funktion von Gewebsmakrophagen wie z.B. Mikroglia oder auch von dendritischen Zellen (DC) beeinflussen kann. Mikroglia stellen die wichtigsten Immunzellen des zentralen Nervensystems  (ZNS) dar und spielen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der MS. Aktivierte Mikroglia können zum einen durch die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren zu einer Gewebeschädigung im ZNS beitragen, zum anderen können sie durch die Präsentation von Antigenen gegen Myelin infiltrierende T-Zellen reaktivieren. Voraussetzung für eine Schädigung des ZNS durch diese antigen-spezifischen T-Zellen ist ihre Prägung in der Peripherie. DC repräsentieren die potentesten Antigen präsentierenden Zellen (APC) in der Peripherie und haben die Fähigkeit T-Zellen zu prägen. Dieser Prozess ist streng reguliert und die T-Zell-Antwort richtet sich in der Regel gegen körperfremde Antigene. Richtet sich die T-Zell-Antwort allerdings gegen körpereigene Proteine kommt es zu einer Autoimmunreaktion. So richtet sich bei der MS die autoimmune T-Zell-Antwort gegen Myelinproteine im ZNS.  Die T-Zellprägung durch DC hat somit eine Schlüsselfunktion bei der Kontrolle von Autoimmunreaktionen.  Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Einflusses von CdA in vitro auf Mikroglia anhand einer primären Rattenzellkultur als auch ex vivo auf humane, aus Monozyten generierten DC. Wir konnten zeigen, dass CdA die Proliferation von Mikroglia hemmt und Apoptose durch einen intrinsischen mitochondrialen Wirkmechanismus induziert. Eine Hemmung der Proliferation fand sich bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt gefolgt von einer Aktivierung von Caspase -3 and -9. Allerdings zeigten sich eine Externalisierung von Phosphatidylserin (PS), Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und eine DNA Fragmentierung erst zu späteren Zeitpunkten. CdA führte allerdings zu keiner Aktivierung von LC3B, ein Protein was bei autophagischen Prozessen eine wichtige Rolle spielt. Es ist somit anzunehmen, dass die verzögerte Apoptose in Mikroglia durch CdA nicht durch die Induktion von Autophagozytose bedingt ist. Darüberhinausgehend konnten wir keinen Einfluss von CdA auf die Phagozytose-Kapazität von Mikroglia oder die Sekretion von LPS-induzierten TNF-α und Stickstoffmonoxid (NO) feststellen. In unseren Experimenten zeigte CdA somit vor allem einen zytotoxischen und keinen immunmodulierenden Effekt auf Mikroglia. Des Weiteren untersuchten wir den Einfluss von CdA auf humanen, aus Monozyten generierten DC.  Obwohl CdA frühzeitig Apoptose in Monozyten induzierte, zeigten sich DC zunächst relativ resistent in Bezug auf die Behandlung mit CdA und erst zu späteren Zeitpunkten kam es zur Apoptose. Interessanterweise war die durch CdA induzierte Apoptose in Monozyten durch die Aktivierung von Caspasen und durch einen intrinsischen mitochondrialen Wirkmechanismus vermittelt. Im Gegensatz dazu fand sich in den DC keine Aktivierung der Caspasen. Schlüsselmechanismen der Apoptose wie die PS Externalisierung, Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und eine DNA Fragmentierung fanden sich erst nach 72 Stunden, wobei wir eine Aktivierung von p53 bereits zu früheren Zeitpunkten feststellen konnten. Es zeigten sich keine Unterschiede der mRNA und Protein Expression der Deoxyzytidin-Kinase (DCK), ein Schlüsselenzym bei der Regulierung der CdA Aktivität innerhalb von Zellen. Zusammenfassend konnten wir feststellen, dass CdA zwar frühzeitig Apoptose in Monozyten auslöst jedoch erst zu späteren Zeitpunkten in Mikroglia und DC. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass innerhalb verschiedener Zelltypen unterschiedliche Apoptosemechanismen eine Rolle spielen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass CdA zu einer Reduktion von Mikroglia und DC durch Hemmung der Proliferation bzw. Induktion von später Apoptose führen kann. Da CdA die Bluthirnschranke überwinden kann, könnten sich diese Effekte auch auf Mikroglia im ZNS und infiltrierende Makrophagen bei MS Patienten auswirken. Diese Effekte von CdA könnten eine Erklärung dafür sein, dass CdA nicht nur bei der schubförmigen MS, sondern auch im progredienten Krankheitsstadium wirksam ist, wo die inflammatorische Immunantwort in der Periphere durch eine Kompartimentierung des Entzündungsprozesses innerhalb des ZNS nur noch eine untergeordnete Rolle spielt.