Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der angeborenen Immunantwort von equinen Makrophagen auf bakterielles Lipopolysaccharid

Winkler, Sonja

Endotoxemia is one of the leading causes of death in horses provoked by gastrointestinal disorders. Main initiators are Gram-negative bacteria and their membrane-components, especially the immunological active endotoxin (lipopolysaccharide; LPS). LPS is able to cross the destroyed intestinal mucosal barrier and enter the blood-circulation. The recognition of LPS by mononuclear phagocytes causes their activation, resulting in a secretion of proinflammatory cytokines as an essential trigger of septicaemia and shock. The receptorcomplex for the detection of bacterial LPS belongs to the group of pattern-recognitionreceptors and consists of the signal-mediating Toll-like-receptor-4 (TLR4) and the globular extracellularly bound on TLR4 protein MD-2. The TLR4/MD-2-receptorcomplex shows a characteristic species-dependent specificity of recognition of the Lipid-A moiety of LPS. One of the best known examples is the tetraacylated Lipid-A which has an antagonistic function in the human system by inhibiting hexaacylated Lipid-A but operates as an agonist in the murine system by causing cell activation. A similar coherence has been observed in the equine system. The molecular basis for activation of equine macrophages were, however, still unclear and should be expanded by the current study. In order to elucidate structure-activity-relations of various endotoxin-structures on the equine TLR4/MD-2-receptorcomplex a heterologous expression-system was established in the human HEK293 cell line (HEK293-eqTLR4/eqMD-2). The reactivity of the equine receptors were first characterized by variation of the expression conditions and stimulation with highly active LPS of E.coli. Subsequently, the activity of the equine receptor complex was analyzed in comparison to the human receptor complex (HEK293-huTLR4/huMD-2) by a selection of chemically defined LPS-preparations and synthetic structures of LPS and Lipid-A. These investigations were aimed at establishing a structure-activity profile and at the identification of compounds with low or no biological activity which could serve as potential antagonists. The equine receptor proteins eqTLR4/eqMD-2 showed reactivity to most of the selected compounds which were inactive or exhibited low activity on the human receptors huTLR4/huMD-2. Compared to the reactivity of the human receptor, the equine receptor has a much broader range of activating ligands assigning the equine receptor proteins a central role for the hyperreactivity of equine cells. To transfer these findings on the receptor function in the heterologous expression system to an equine cell system a series of experiments were performed on equine macrophages. One of the main conclusions of these experiments was that the equine receptor proteins eqTLR4/eqMD-2 in HEK293 cells and equine macrophages showed a showed highly similar activation profile. These results support a central role of the receptor complex for the specific activation profile of equine cells. The synthetic Lipid-Analog E5564 was identified as not active on both, HEK293eqTLR4/eqMD-2 cells as well as on equine macrophages. In both cell-systems inhibition of LPS-mediated cell activation could be demonstrated. E5564 significantly inhibited cell activation by LPS in a concentration range of 10 ng/ml -1 µg/ml. Higher concentration completely inhibited cytokine production induced by LPS (1 ng/ml – 100 ng/ml). Septicemia triggered by Gram-negative bacteria is poorly treatable with antibiotics as they do not diminish the endotoxic activity of LPS and may even induce its release. Antagonistic molecules, that are therapeutically useful, are an alternative strategy for the treatment of septicemia caused by endotoxins, so that an accurate knowledge of the mechanisms of activation is of great importance. The results of this study contributed to the elucidation of the structure-activity relations underlying the activation of equine macrophages via the TLR4/MD-2 receptor.

Endotoxämie, verursacht durch gastrointestinale Störungen, ist eine der häufigsten Todesursachen bei Pferden. Initiatoren sind Gram-negative Bakterien und ihre Membran-Komponenten, insbesondere das immunologisch aktive Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS). LPS ist in der Lage die beeinträchtigte Darmschleimhaut zu überwinden und in die Blut-Zirkulation zu gelangen. Die Erkennung des LPS durch mononukleäre Phagozyten verursacht ihre Aktivierung, die zu einer Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen als wesentliche Auslöser von Sepsis und Schock führt. Der Rezeptorkomplex zur Erkennung des bakteriellen LPS gehört zur Gruppe der Mustererkennungsrezeptoren und besteht aus dem Signal vermittelnden Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) und dem globulären extrazellulär an TLR4 gebundenen Protein MD-2. Der TLR4/MD-2-Rezeptorkomplex unterschiedlicher Spezies weist eine charakteristische Spezifität der Erkennung von Endotoxinen, insbesondere des aktiven Molekülbestandteils Lipid-A auf. Das tetraazylierte Lipid-A, das im humanen System eine antagonistische Funktion übernimmt und biologisch hoch aktives hexaazyliertes Lipid-A hemmt, wirkt im murinen System agonistisch und vermittelt eine Zellaktivierung. Ähnliche Zusammenhänge konnten auch fürs Pferd beschrieben werden. Die molekularen Grundlagen für die Aktivierung equiner Makrophagen waren bislang jedoch noch weitgehend unklar und sollten mit Hilfe dieser Arbeit erweitert werden. Zur Aufklärung von Struktur-Wirkungsbeziehungen verschiedener Endotoxinstrukturen auf den equinen TLR4/MD-2-Rezeptorkomplex wurde ein transientes heterologes Expressionssystem der equinen Rezeptoren TLR4 und MD-2 in HEK293-Zellen (HEK293eqTLR4/eqMD-2) etabliert. Die Reaktivität der equinen Rezeptoren wurde zunächst durch Variation der Expressionsbedingungen der Proteine und durch Stimulation mit hoch aktivem LPS von Escherichia coli charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung des equinen Rezeptorkomplexes vergleichend zum humanen Rezeptorkomplex (HEK293huTLR4/huMD-2) mit einer Auswahl chemisch definierter LPS-Präparate und synthetischer LPS-und Lipid-A-Strukturen analysiert. Diese Untersuchungen dienten zu einen der Erstellung eines Struktur-Wirkungs-Profils und zum Anderen der Identifizierung schwach aktiver Substanzen deren Wirkung als potentielle Antagonisten in der Folge untersucht wurde. Die equinen Rezeptorproteine eqTLR4/eqMD-2 zeigten bei Expression in humanen HEK293 Zellen Aktivierung auf eine breite Palette von Endotoxinstrukturen und -analoga, die auf den humanen Rezeptoren huTLR4/huMD-2 kaum oder keine Aktivierung zeigten. Dieses im Vergleich zum humanen Rezeptorsystem breitere Spektrum an aktivierenden Endotoxinliganden weist dem equinen Rezeptorsystem eine zentrale Rolle bei der Hyperresponsivität equiner Zellen zu. Zur Übertragung der Befunde an equinen Rezeptorproteinen im heterologen Expressionssystem auf ein equines Zellsystem wurde eine Reihe von Untersuchungen an primären equinen Makrophagen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Übereinstimmung des Aktivierungsprofils des equinen Rezeptorkomplexes in HEK293-Zellen und equiner Makrophagen und unterstützen somit die Bedeutung des Rezeptorkomplexes für das spezifische Aktivierungsprofil equiner Zellen. Das synthetische Lipid-A-Analog E5564 konnte sowohl in HEK293-eqTLR4/eqMD-2 Zellen wie auch auf equinen Makrophagen als nicht aktiv identifiziert werden. In beiden Zellsystemen konnte eine Inhibierung der Wirkung von LPS gezeigt werden. E5564 zeigten im Konzentrationsbereich von 10 ng/ml -1 µg/ml eine signifikante Abschwächung der LPS-vermittelten Zellaktivierung. Konzentrationen von 1 µg/ml E5564 konnten die Produktion der Zytokine durch LPS (1 ng/ml – 100 ng/ml) komplett inhibieren. Die durch Gram-negative Erreger ausgelöste Sepsis ist nur mangelhaft mit Antibiotika therapierbar, da diese nicht die endotoxische Aktivität des LPS abschwächen und sogar dessen Freisetzung induzieren können. Therapeutisch einsetzbare antagonistische Moleküle stellen eine alternative Strategie zur Behandlung von endotoxinverursachten septischen Geschehen dar, so dass eine genaue Kenntnis der Aktivierungsmechanismen von hoher Bedeutung ist. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Aufklärung von Struktur-Wirkungsbeziehungen bei der Aktivierung equiner Makrophagen über den TLR4/MD-2-Rezeptor geleistet.

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Winkler, Sonja: Untersuchung der angeborenen Immunantwort von equinen Makrophagen auf bakterielles Lipopolysaccharid. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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