Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende in vitro-Analyse kaniner olfaktorischer Hüllzellen und Schwann-Zellen unter Berücksichtigung neuroregenerativer Eigenschaften und deren Bedeutung für zelltransplantationsbasierte Behandlungen von Rückenmarksverletzungen

Ziege, Susanne

Spinal cord injuries (SCIs) in dogs display one of the most common neurologic disorders. Although great therapeutic progress exists, for up to 50 % of the affected animals still a poor prognosis is provided. During the last years increasing interest in transplantation of regenerative cells like peripheral Schwann cells and olfactory ensheathing cells (OECs) as a potential alternative therapy arose. Despite the assumption that the great regenerative capacity of peripheral nerves is due to Schwann cells, it is postulated that OECs have special and superior regenerative properties. OECs conduct axons of the olfactory neurons that evince neurogenesis throughout lifetime; furthermore, OECs are present in the peripheral and central nervous system. Until now the controversy about the regenerative potential of either Schwann cells or OECs is not resolved and there is still discussion about results of well characterized rodent models. Moreover the known presence of “contaminating” Schwann cells in OEC preparations due to the lack of cell type-specific markers in vitro avoids selective visualization of these two glial cells, while a differential antigen expression is described in situ. Additionally, it remains to be elucidated whether OECs derived from the olfactory mucosa display comparable regenerative capacities as supposed for olfactory bulb-OECs. One essential aim of the present study was, therefore, the visualization and depletion of Schwann cells from primary cell suspensions derived from the olfactory mucosa and bulb using a novel two-step purification protocol to define the amount of “contaminating” Schwann cells and thus to establish Schwann cell-free OEC preparations for the first time. Another aim was the comparative in vitro-analysis of olfactory mucosa-derived OECs (OM-OECs) and OECs from the olfactory bulb (OB-OECs) as well as Schwann cells derived from the fibular nerve (FN-SCs). Referring to this, all three cell types were cultured and examined under same culture conditions and experiments and using the same evaluation system. Furthermore, antigen expression and cell proliferation were determined. Myelinating (HNK-1-positive) and non-myelinating Schwann cells (p75NTR-positive) in primary cell suspensions of the olfactory mucosa represented about 21 % of total cells. In case of the olfactory bulb, 8 % of total cells displayed expression of p75NTR. Correlation to the amount of all glial cells (CNPase-positive) within these preparations revealed a ratio of OECs and Schwann cells of 1:1 and 1:3 in cell suspensions of the olfactory mucosa and bulb, respectively. Although attendance of p75NTR-positve stem cells has to be considered, these data demonstrate the necessity of Schwann cell depletion from OEC preparations in order to allow a comparative analysis of the regenerative potential of OECs and peripheral Schwann cells as a basis to classify the observed effects to one of the two cell types. Purification of OECs and Schwann cells was done by magnet-activated cell sorting and efficiency of more than 95 % was controlled by immunolabeling of p75NTR. Subtle differences between OM-, OB-OECs and FN-SCs already appeared during cultivation in the absence of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) where OM-OECs displayed the most flattened phenotype. The second part of this study revealed that all three cell types promote axonal growth. Using dorsal root ganglion (DRG) explants as well as dissociated DRG neurons OM-OECs represented the most potent cell type. In DRG explant cultures OB-OECs outmatched FN-SCs. Furthermore OM-OECs caused a higher arbori-zation of the neurites, despite a comparable number of neurites that expanded directly from the soma of the neurons in all three cocultures, compared to OB-OECs and FN-SCs. Similar effects are described for astrocytes and therefore allude that OECs probably incorporate properties of peripheral and central glia. To what extent the complexity of DRG neurons cocultured with OM-OECs is adverse for directional neurite growth, has to be clarified in future studies. Interestingly, neurites developed significantly less frequently in direct contact to OM-OECs than in cocultures with OB-OECs and FN-SCs. If this effect is due to a differential secretion of soluble factors or different expression of adhesion molecules by the glial cells, has to be defined in following studies. In addition all three cell types displayed a comparable proliferative activity in the absence of mitogens as well as in the presence of FGF-2 and Heregulin-1β. The special responsiveness of OM-OECs to ciliary neurotrophic factor represents another possible cell type-specific property. The mentioned findings illustrate the necessity for further studies that should especially concentrate on the remyelinating capacity in order to achieve a basic understanding of the complete regeneration potential of the investigated glial cells in the central nervous system. A collective consideration of these entire results will then help to identify the most potent cell type for an autologous cell transplantation-based therapy for SCI that may additionally serve as solid data for the translation into the human disease.

Verletzungen des Rückenmarkes zählen bei der Spezies Hund zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen. Obwohl bezüglich der Therapie deutliche Fortschritte erzielt wurden, wird für etwa 50 % der erkrankten Tiere noch immer eine schlechte bis infauste Prognose gestellt. Seit einiger Zeit rückte, als alternativer Therapieansatz, die Transplantation regenerationsfördernder Zellen in den Vordergrund, wobei unter anderem periphere Schwann-Zellen und olfaktorische Hüllzellen (OECs) eine wichtige Rolle spielen. Schwann-Zellen erlangten aufgrund der guten Regenerationsfähigkeit peripherer Nerven ein gesteigertes Interesse. Allerdings führte die Tatsache, dass OECs die Axone der sich zeitlebens erneuernden olfaktorischen Rezeptorneurone des olfaktorischen Epithels auf ihrem Weg von der Riechschleim-haut bis zum Bulbus olfactorius begleiten und dieser Zelltyp demnach sowohl im peripheren, als auch im zentralen Nervensystem vorkommt, zu der Annahme, dass sie ein den Schwann-Zellen überlegenes regeneratives Potential besitzen. Bisher konnte diese Fragestellung nicht geklärt werden, da die selbst am gut charakterisierten Nagermodell erhobenen Befunde kontrovers diskutiert werden. Ferner ist bekannt, dass in OEC-Präparationen „kontaminierende“ Schwann-Zellen vorhanden sind, die eventuell für einige, den OECs zugesprochenen Effekte verantwortlich sein könnten. Grund hierfür ist der Mangel an Zelltyp-spezifischen Markern, der bislang eine selektive Darstellung beider Zellpopulationen in vitro unmöglich machte. In situ allerdings weisen Schwann-Zellen und OECs eine differentielle Marker-Expression auf. Zudem ist nicht geklärt, inwiefern OECs des Bulbus olfactorius und OECs des olfaktorischen Epithels vergleichbare Eigenschaften aufweisen. Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Visualisierung und Depletion der in Primärzellsuspensionen der kaninen Riechschleimhaut und des Bulbus olfactorius enthaltenen Schwann-Zellen mittels eines neuartigen zwei-stufigen Reinigungsverfahrens. Dadurch sollten zum einen der Gehalt an „kontaminierenden“ Schwann-Zellen bestimmt und zum anderen erstmals Schwann-Zell-freie OEC-Kulturen hergestellt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der vergleichenden in vitro-Charakterisierung der OECs der Riechschleimhaut (OM-OECs) und des Bulbus olfactorius (OB-OECs) sowie der Schwann-Zellen des Nervus fibularis (FN-SCs). Diesbezüglich wurden erstmalig alle drei Zelltypen unter identischen Kultivierungs- und Versuchsbedingungen sowie anhand gleicher Auswertungsparameter analysiert. Unter Verwendung von Ko-Kultursystemen mit Spinalganglienneuronen wurden neuroregenerative Eigenschaften bewertet. Ferner erfolgten in vitro-Untersuchungen hinsichtlich Antigenexpression und Proliferationsverhalten. Myelinisierende (HNK-1-positiv) und nicht-myelinisierende Schwann-Zellen (p75NTR-positiv) stellten in den Primärzellsuspensionen der Riechschleimhaut etwa 21 % der gesamten Zellen dar. In den Zellsuspensionen des Bulbus olfactorius wiesen 8 % aller Zellen eine positive Markierung mittels anti-p75NTR Antikörpern auf. Bezogen auf die gesamten Gliazell-Gehalte (CNPase-positiv), ergab sich für die Riechschleim-haut ein Verhältnis von OECs zu Schwann-Zellen von 1:1 und im Falle des Bulbus olfactorius von 1:3. Obwohl eine gewisse Verfälschung der Ergebnisse durch beispielsweise p75NTR-positive Vorläuferzellen zu berücksichtigen ist, verdeutlichen die ermittelten Werte, im Hinblick auf eine vergleichende Analyse des neuro-regenerativen Potentials von OECs und peripheren Schwann-Zellen, die Notwendigkeit der Schwann-Zell-Depletion aus OEC-Präparationen. Denn nur dadurch wird es möglich, beobachtete Effekte tatsächlich einem der Zelltypen zuordnen zu können. Ein Reinheitsgrad von über 95 % der OEC- und Schwann-Zell-Kulturen wurde über das magnet-activated cell sorting erzielt und mittels immunzytochemischem Nachweis von p75NTR kontrolliert. Subtile Unterschiede zwischen OM-, OB-OECs und FN-SCs erbrachte bereits die Kultivierung der Zellen in Abwesenheit des Fibro-blastenwachstumsfaktors-2 (FGF-2), bei der OM-OECs einen am deutlichsten abgeflachten Phänotyp aufwiesen. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigte ferner, dass alle drei Zelltypen axonales Wachstum fördern, wobei sich sowohl in den Explantat-Kulturen, als auch mittels dissoziierter Spinalganglienneurone, die OM-OECs als potentester Zelltyp heraus-stellten. In den Explantat-Kulturen waren ebenfalls die OB-OECs den FN-SCs über-legen. Des Weiteren wiesen OM-OECs im Vergleich zu OB-OECs und FN-SCs einen höheren Verzweigungsgrad der Nervenzellfortsätze auf, obwohl die Anzahl der Neuriten, die direkt vom Soma der Neurone abgehen, bei allen drei Gliazell-Typen ähnlich war. Dieses Ergebnis könnte, aufgrund beschriebener Effekte von Astrozyten auf den Verzweigungsgrad von Neuronen, ein weiterer Hinweis dafür sein, dass OECs neben Eigenschaften peripherer Gliazellen auch jene zentraler Glia in einem Zelltyp widerspiegeln. Inwieweit diese Beobachtung allerdings ein gerichtetes axonales Wachstum nach Transplantation behindern könnte, gilt es in folgenden Studien zu klären. Interessanterweise wuchsen die Fortsätze der Spinalganglienneurone signifikant weniger in direktem Kontakt zu OM-OECs als es bei OB-OECs oder FN-SCs der Fall war. Ob bzw. inwiefern dieser Effekt durch unterschiedlich sezernierte Substanzen bzw. unterschiedlich exprimierte membrangebundene Adhäsionsmoleküle der Gliazellen bedingt ist, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Des Weiteren wiesen alle drei Zellpräparationen eine vergleichbare Proliferation und Wachtumsfaktorresponsivität bezüglich der Zugabe von FGF-2 und Heregulin-1β auf. Die Steigerung der proliferativen Aktivität von OM-OECs bei Zusatz des ciliary neurotrophic factors ist wahrscheinlich als weitere Zelltyp-spezifische Eigenschaft zu interpretieren. Die dargestellten Befunde verdeutlichen die Notwendigkeit weiterer Studien, um vor allem die für eine vollständige Regeneration erforderliche Remyelinisierungskapazität der Gliazellen zu analysieren und somit unter Berücksichtigung aller Ergebnisse den für die autologe zelltransplantationsbasierte Therapie von Rückenmarksverletzungen am besten geeigneten Zelltyp zu identifizieren und solide Daten zu erzeugen, die eine zuverlässige und sichere Übertragbarkeit auf den Menschen gewährleisten.

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Ziege, Susanne: Vergleichende in vitro-Analyse kaniner olfaktorischer Hüllzellen und Schwann-Zellen unter Berücksichtigung neuroregenerativer Eigenschaften und deren Bedeutung für zelltransplantationsbasierte Behandlungen von Rückenmarksverletzungen. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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