Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Virulence mechanisms of Streptococcus suis

Seitz, Maren

Streptococcus (S.) suis is a swine pathogen of the upper respiratory tract causing meningitis, arthritis and septicaemia. Due to high economical losses S. suis is considered as an important pathogen in pig husbandry worldwide. Asymptomatically colonized carrier-pigs are the most important source of infection. Moreover, S. suis is a zoonotic agent associated with meningitis and the streptococcal toxic shock like syndrome (STSS) in humans. Suilysin is a secreted virulence-associated haemolysin of S. suis. It is present in many S. suis strains and belongs to the family of Cholesterol-dependent pore-forming cytolysins (CDC). At high concentrations these multifunctional toxins lyse host cells. Additional biological activities of CDC such as the activation of host cells or immune modulation, occur at subcytolytic concentrations. The role of suilysin in pathogenesis of S. suis is still unclear. The aim of this study was to analyse the role of suilysin in pathogen-host cell interaction and to characterise the molecular mechanisms underling suilysin-mediated biological effects. Using an isogenic suilysin-negative mutant strain and the human respiratory epithelial cell line HEp-2 a suilysin-dependent invasive phenotype of an unencapsulated S. suis serotype 2 strain was identified in vitro. Subcytolytic concentration of suilysin activated the small Rho-GTPase Rac1, which resulted in formation of membrane ruffles and finally led to the uptake of S. suis by the cell. Furthermore, point-mutation of the putative pore-forming region of the suilysin gene abolished cytolytic activity, but activation of the G-protein Rac1 was unaffected. A second putative functional region, a RGD-motif, was identified and also point-mutated, resulting in loss of lytic activity, membrane binding and the ability to activate Rac1. Thus, the RGD-motif is proposed to be involved in suilysin-mediated host cell-activation. Integrins as possible interaction partners were identified on the surface of HEp-2 cells, but further studies are needed to proof the precise role of integrins in suilysin-mediated host cell-interaction. After characterization of suilysin-dependent effects in vitro, an intranasal mouse infection model for S. suis was established to investigate the role of suilysin in colonisation and invasion of S. suis in vivo. After predisposition with acetic acid followed by mucosal application of a S. suis serotype 2 strain we were able to induce colonisation of the upper respiratory tract as well as invasive disease associated with rhinitis, pneumonia and/or meningitis in mice. The suilysin-negative mutant strain colonised the respiratory epithelium, but was slightly attenuated in virulence in comparison to the wild type strain. Taken together, these results show that subcytolytic activity of suilysin plays a role in pathogen-host cell interaction. The established mouse model is suitable to study the relevance of subcytolytic activities of suilysin in vivo in the future. The results of this work improved our understanding of S. suis pathogenicity mechanisms.

Streptococcus (S.) suis ist ein Erreger im oberen Respirationstrakt des Schweins, der vor allem Meningitiden, Arthritiden und Septikämien verursacht. Aufgrund von hohen Verlusten in der Schweineproduktion sind S. suis-bedingte Erkrankungen weltweit von großer Bedeutung. Epidemiologisch bedeutsam sind vor allem klinisch inapparente Trägertiere, die als wichtigstes Reservoir für Neuinfektionen gelten. Zudem besitzt S. suis ein zoonotisches Potential und spielt beim Menschen sowohl eine wichtige Rolle als Meningitiserreger als auch als Verursacher des streptococcal toxic shock like syndrom (STSS). Zu den virulenzassoziierten Faktoren von S. suis gehört das Suilysin, welches ein sezerniertes Hämolysin ist. Dieses tritt bei vielen Stämmen auf und zählt zur Familie der cholesterol-dependent pore-forming cytolysins (CDC). Diese multifunktionalen Toxine führen in hoher Konzentration zur Lyse von Wirtszellen. Neben diesen lytischen Effekten sind auch biologische Aktivitäten im subzytoloytischen Bereich, wie die Aktivierung von Wirtszellen oder immunmodulatorische Effekte, von Bedeutung. Die genaue Rolle des Suilysins in der Pathogenese von S. suis ist bisher nicht hinreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Bedeutung von Suilysin in der Erreger-Wirtszell-Interaktion und die molekularen Mechanismen Suilysin-vermittelter biologischer Effekte näher zu untersuchen. Mit Hilfe einer isogenen Suilysin-negativen Mutante konnte in in vitro Untersuchungen an der humanen respiratorischen Epithelzelllinie HEp-2 ein Suilysin-abhängiger invasiver Phänotyp eines unbekapselten S. suis-Serotyp-2-Stammes gezeigt werden. Die durch subzytolytische Suilysin-Konzentration induzierte Aktivierung der kleinen Rho-GTPase Rac1 vermittelte hierbei die Ausbildung von membrane ruffles, wodurch S. suis in die Zelle aufgenommen wurde. Des Weiteren konnte durch gezielte Punktmutagenese im Suilysin-Gen der putative Poren-bildende Bereich ausgeschaltet werden, was zu einem Verlust der zytolytischen Aktivität führte, nicht aber die G-Protein-aktivierende Eigenschaft des Suilysins beeinflusste. Neben dem für die Porenbildung notwendigen Bereich im Suilysin-Gen, wurde eine weitere putative funktionale Domäne, ein RGD-Motiv, identifiziert und ebenfalls punktmutiert. Der dadurch bedingte Verlust der zytolytischen Aktivität, der Bindung des Suilysins an die Wirtszell-Membran und der Rac1-Aktivierung, weist auf eine Beteiligung des RGD-Motivs an der Suilysin-vermittelten Interaktion mit Wirtszellen hin. Als mögliche Interaktionspartner konnten Integrine auf der Zelloberfläche von HEp-2-Zellen identifiziert werden, dennoch sind weitere funktionelle Studien erforderlich, um die genaue Rolle von Integrinen in der Suilysin-vermittelten Zell-Aktivierung aufzuklären. Nach der Charakterisierung Suilysin-abhängiger Effekte im Zellkultursystem wurde ein intranasales Mausinfektionsmodells für S. suis etabliert, um die Bedeutung des Suilysins für die Kolonisation und Invasion von S. suis in vivo zu untersuchen. Nach vorheriger Prädisposition mit Essigsäure war es möglich durch mukosale Applikation des S. suis-Serotyp-2-Stammes eine Besiedlung des oberen Respirationstraktes sowie das Auftreten von Rhinitis, Pneumonie und/oder Meningitis in der Maus zu induzieren. Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm erwies sich die Suilysin-negative Mutante als geringgradig virulenzattenuiert, wohingegen keine Unterschiede in der Kolonisation beobachtet wurden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Suilysin nicht nur zytolytische Aktivitäten besitzt, sondern auch unter subzytolytischen Bedingungen eine Bedeutung in der Erreger-Wirtszell-Interaktion hat. Die weitere Klärung der Relevanz subzytolytischer Aktivitäten des Suilysins in vivo kann zukünftig durch das im Rahmen dieses Projektes etablierten Mausmodels näher geklärt werden. Damit wurde ein Beitrag zum besseren Verständnis von Pathogenitätsmechanismen von S. suis geleistet.

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Seitz, Maren: Virulence mechanisms of Streptococcus suis. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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