Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparative investigations on interspecies adaptation of low-pathogenic avian influenza viruses (AIV) and the impact of NS-reassortment of highly-pathogenic AIV on virus-host interactions in different poultry species

Petersen, Henning

Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) of subtypes H5 and H7 have caused numerous outbreaks in diverse poultry species. Rising numbers of human infections with both HPAIV subtypes support a growing concern of a pandemic outbreak specifically via the avian-human link. Natural reassortment of both HPAIV subtypes is a possible event with unpredictable outcome for virulence and host specificity of the progeny virus for avian and mammalian species. Interspecies transmission of low-pathogenic avian influenza viruses (LPAIV) between different avian species is a frequent event. In the adaptation process to a new species, LPAIV acquire genome mutations that allow efficient infection of new host target cells, which may be accompanied by a change in virus virulence. Not much is known about susceptibility of different avian species to different LPAIV subtypes and their role in the process of LPAIV evolution. The objectives of the first part of the study were to analyze interspecies transmission of LPAIV of different subtypes between different poultry species using in vitro methods and to detect genome mutations during the adaptation process. The replication and adaptation of LPAIV of subtypes H9N2, H7N7 and H6N8 was compared in tracheal organ cultures (TOC) and primary embryo fibroblast (EF) cultures of chicken, turkey, Pekin duck and homing pigeon. Virus strain-dependent and avian species-related differences between LPAIV were observed in growth kinetics and induction of ciliostasis in TOC. Susceptibility to AIV varied significantly between cell cultures of different bird species tested, with respiratory cells of turkey being highly susceptible and those of pigeon showing the lowest LPAIV replication rates. Three consecutive virus passages in the cells of heterologous host species resulted in adaptive mutations in the AIV genome, especially in the receptor-binding site and protease cleavage site of the hemagglutinin. This data highlights the potential of some LPAIV subtypes to rapidly adapt to new host species. In the second part of the study, the impact of NS-reassortment on HPAIV replication and the potential to counteract the host’s innate immune response was analyzed in TOC in vitro as well as in an embryonated egg model of chicken and turkey in vivo. Therefore, FPVNS-reassortants carrying NS-segments of A/Vietnam/1203/2004 (FPV NS VN, H5N1) HPAIV, A/goose/Guangdong/1/1996 (FPV NS GD, H5N1) HPAIV and A/mallard/NL/12/2000 (FPV NS Ma, H7N3) LPAIV were compared with the wild-type A/FPV/Rostock/1934 (FPV wt, H7N1) HPAIV. Single NS-reassortment of an H7-type HPAIV with NS-segments of different subtypes significantly changed the virus replication characteristics and host cell answer in the avian system without prior adaptation. Depending on the NS-segment, the NS-reassortant HPAIV varied in their growth characteristics and virulence in the in vitro TOC system. NS-reassortment of wild-type FPV H7N1 HPAIV with A/Vietnam/1203/2004 (FPV NS VN) changed the virus growth characteristics in TOC of chicken and turkey with increased induction of type I IFN and apoptosis rates accompanied by low replication efficiency. Hence, FPV NS VN failed to suppress the antiviral host answer in vitro with negative implications for virus replication. Interestingly, in vivo infection of chicken and turkey embryos demonstrated increased virulence for FPV NS VN compared to the wild-type virus, as demonstrated by faster replication and more severe lesion development. Data from the embryo infection model seem to correlate with in vivo studies in birds and demonstrate an interesting alternative to animal studies. Overall, this study demonstrates the differences between avian species in their potential role to support the emergence of new LPAIV variants during in vitro adaptation as well as the impact of NS reassortment on HPAIV replication and antiviral host response of chicken and turkey in vitro and in vivo.

Hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) vom Subtyp H5 und H7 sind für zahlreiche Ausbrüche der klassischen Geflügelpest in Beständen mit unterschiedlichen Geflügelspezies verantwortlich. Die steigende Zahl von Infektionen des Menschen mit beiden HPAIV Subtypen über das Geflügel zeigt die Bedeutung dieses Übertragungsweges. Die natürliche Reassortierung von HPAIV Genomsegmenten zwischen Subtyp H5 und H7 ist möglich und stellt ein hohes Pandemierisiko für Geflügel und den Menschen dar. Das Wissen über die Virulenz und Wirtsspezifität solch neu reassortierter HPAIV für verschiedene Spezies ist sehr begrenzt. Niedrigpathogene Aviäre Influenzaviren (LPAIV) werden häufig zwischen verschiedenen Vogelspezies übertragen. Bei der Transmission und Adaptation von LPAIV an Zielzellen neuer Spezies kommt es zu Mutationen des Virusgenoms, welche Grundvoraussetzung für eine effizientere Replikation des Virus darstellen, und somit auch die Virulenz des Erregers beeinflussen können. Über die Empfänglichkeit verschiedener aviärer Spezies für LPAIV unterschiedlichen Subtyps, als auch deren Rolle in der Evolution neuer LPAIV-Varianten, ist wenig bekannt. Ziel der Studie war die Untersuchung unterschiedlicher LPAIV Subtypen auf ihr Potential, sich an verschiedene Vogelspezies anzupassen und mögliche adaptive Mutationen im Virusgenom zu beschreiben. Die Replikation und Adaptation von LPAIV der Subtypen H9N2, H7N7 und H6N8 wurden in Trachealringkulturen (TOC) und primären Embryofibroblasten (EF) von Huhn, Pute, Pekingente und Brieftaube in vitro vergleichend untersucht. Untersucht wurden mögliche Virus- und Vogelspezies-spezifische Unterschiede zwischen den genannten LPAIV in der Wachstumskinetik und Induktion von Ziliostase in TOC. Hierbei zeigte sich, dass die LPAIV-Empfänglichkeit in primären Zellen unterschiedlicher Vogelspezies variierte. Dabei zeigten TOC und EF der Pute die höchste Empfänglichkeit für die untersuchten LPAIV, während diese in den Zellen der Brieftaube am schlechtesten replizierten. Adaptive Mutationen wurden nach drei aufeinanderfolgenden Viruspassagen in Zellen von heterologen Wirtsspezies detektiert. Diese befanden sich hauptsächlich in den funktionellen Regionen der Rezeptorbindungsstelle sowie Spaltstelle des Influenza Hämagglutinins. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich bestimmte LPAIV-Subtypen sehr schnell an neue Wirtsspezies anpassen können. Weiterhin wurde der Einfluss von NS-Reassortierung auf die HPAIV-Replikation als auch auf die angeborene Immunantwort in TOC und auch in Embryos von Huhn und Pute untersucht. Dazu wurden NS-reassortierte HPAIV mit ausgetauschtem NS-Segment von A/Vietnam/1203/2004 (FPV NS VN, H5N1) HPAIV, A/goose/Guangdong/1/1996 (FPV NS GD, H5N1) HPAIV oder A/mallard/NL/12/2000 (FPV NS Ma, H7N3) LPAIV mit dem wild-Typ Stamm A/FPV/Rostock/1934 (FPV wt, H7N1) HPAIV verglichen. NS-Reassortierung eines H7-Typ HPAIV mit NS-Segmenten unterschiedlichen Subtyps führte ohne vorherige Adaptation zu veränderter Virus-Replikation und Immunantwort des Wirtes im aviären System. Die NS-Reassortierung vom wild-Typ FPV H7N1 HPAIV mit A/Vietnam/1203/2004 (FPV NS VN) führte in infizierten TOC von Huhn und Pute zu verminderter Replikationseffizienz in Verbindung mit erhöhter Induktion von Typ I IFN sowie apoptotischen Zellen. FPV NS VN konnte also die antivirale Zellantwort in vitro nicht unterdrücken, mit negativen Auswirkungen auf die Virus-Replikation. Interessanterweise zeigte FPV NS VN nach in vivo Infektion von Hühner- und Putenembryos eine erhöhte Virulenz im Vergleich zum wild-Typ FPV HPAIV, welches durch eine schnellere Replikation und schwerere Läsionen gekennzeichnet war. Die Ergebnisse der Embryoinfektionsstudie scheinen positiv mit in vivo Ergebnissen in Geflügelspezies zu korrelieren und können damit eine interessante Alternative zu Tierversuchen bilden. Zusammenfassend konnte diese Studie zeigen, dass verschiedene aviäre Spezies unterschiedliche Potentiale besitzen, zur Entstehung neuer LPAIV Varianten durch Adaptation in vitro beizutragen. Weiterhin konnte gezeigt werde, dass NS-Reassortierung einen Einfluss auf die Replikation und antivirale Wirtsantwort von HPAIV in Huhn und Pute sowohl in vitro als auch in vivo hat.

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Petersen, Henning: Comparative investigations on interspecies adaptation of low-pathogenic avian influenza viruses (AIV) and the impact of NS-reassortment of highly-pathogenic AIV on virus-host interactions in different poultry species. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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