Comparative molecular analysis of methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. from cases of mastitis among dairy cattle

In den letzten Jahren war Methicillinresistenz bei Staphylokokken von Menschen und Tieren das Thema vieler Studien. Zu Beginn dieses Ph.D.-Projektes waren jedoch nur sehr wenige Daten zur Methicillinresistenz bei Staphylokokken aus Rindermastitiden verfügbar. Die Ziele der vorliegenden Studie waren eine umfassende Charakterisierung von bovinen methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und methicillinresistenten koagulasenegativen Staphylokokken (MRKoNS) aus Mastitisfällen sowie der Vergleich der MRSA CC398-Isolate von Rindern mit entsprechenden Isolaten anderer Herkunft. Die genetische Verwandtschaft und die Resistenzeigenschaften von 25 bovinen und zwei humanen MRSA-Isolaten aus 17 Milchviehbetrieben in Deutschland wurden untersucht. Alle Isolate gehörten zum klonalen Komplex (CC) 398. In der ApaI-Makrorestriktionsanalyse dieser Isolate zeigten sich neun Hauptmuster. Drei spa- (t011, t034 und t2576), zwei SCCmec- (IV, V, ein Isolat nicht typisierbar) und fünf dru-Typen (dt6j, dt10a, dt10q, dt11a, dt11ab) wurden nachgewiesen. Die Empfindlichkeitstestung ergab zehn Resistenzmuster. Neben dem mecA-Gen, das Methicillinresistenz vermittelt, wurden die Gene blaZ (Penicilline), tet(K), tet(L), tet(M) (Tetrazykline), erm(A), erm(B), erm(C), erm(T) (Makrolide, Lincosamide, Streptogramin B), aacA-aphD, aphA3, aadD (Aminoglykoside), spc (Spectinomycin), fexA (Phenicole), dfrK (Trimethoprim), vga(A) und vga(C) (Pleuromutiline, Lincosamide, Streptogramin A) nachgewiesen. Eine ähnliche Situation zeigte sich für ein Testkollektiv von 32 MRSA-Isolate aus Geflügelfleisch/-produkten, das 28 CC398-Isolate mit hoher Variabilität hinsichtlich der Resistenzphäno- und genotypen beinhaltete. Um die Situation auf Betriebsebene zu untersuchen, wurden 125 MRSA CC398-Isolate von verschiedenen Tierarten und Menschen aus 26 niederländischen Milchviehbetrieben charakterisiert. Insgesamt wurden acht spa-Typen (t011, t034, t108, t567, t1184, t1451, t2287, t3934), zwei SCCmec-Typen (IV, V sowie 10 nicht typisierbare Isolate), 12 Resistenzmuster und zahlreiche ApaI-Makrorestriktions-muster nachgewiesen. In den einzelnen Betrieben zeigten sich unterschiedliche Situationen. Während bei einigen Betrieben nicht-unterscheidbare MRSA CC398-Isolate bei Menschen und Tieren nachweisbar waren, deutete das Vorkommen verschiedener MRSA-Typen/Subtypen in anderen Betrieben auf verschiedene Übertragungs-/Eintragswege oder eine Veränderung der MRSA-Isolate im Laufe der Zeit hin. Da die Grenzwerte zur Beurteilung der Methicillinresistenz bei koagulasenegativen Staphylokokken (KoNS) aus der Humanmedizin stammen, wurden 121 Isolate aus Rindermastitiden, den CLSI-Vorgaben entsprechend mit unterschiedlichen Methoden hinsichtlich der korrekten Beurteilung der Methicillinresistenz getestet. Das mecA-Gen wurde bei 15 der 16 resistenten Isolate nachgewiesen. Über Oxacillin-Bouillonmikrodilution wurden 10 mecA-negative Isolate mit MHK-Werten von 0,5 und 1 mg/L als methicillinresistent beurteilt, während mittels Oxacillin- und Cefoxitin-Agardiffusion alle bis auf jeweils ein Isolat korrekt eingeteilt wurden. Daher sollten KoNS mit Oxacillin-MHK-Werten von 0,5 und 1 mg/L das mecA-Gen oder sein Genprodukt nachgewiesen werden, bevor sie als methicillinresistent klassifiziert werden. Die SCCmec-Typisierung der 15 mecA-positiven Isolate ergab SCCmec-Elemente der Typen III, IV und V, wobei ein Isolat nicht typisierbar war. Diese KoNS-Isolate wurden auch für eine Studie zur Entwicklung einer Empfehlung für klinische Grenzwerte für Cefoperazone mit verwendet, welche insgesamt 1086 Isolate aus den USA und Deutschland, einschließlich S. aureus, KoNS, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae und Streptococcus uberis, umfasste. Unter Berücksichtigung der im Rindereuter erreichbaren Cefoperazonkonzentrationen wurden die folgenden Grenzwerte vorgeschlagen: empfindlich [MHK-Werte von ≤ 2 mg/L; Hemmhofdurchmesser von ≥ 27 mm (Staphylokokken/E. coli) und ≥ 21 mm (Streptokokken)], intermediär [MHK-Werte von 4 mg/L; Hemmhofdurchmesser von 22-26 mm (Staphylokokken/E. coli) und 16-20 mm (Streptokokken)] und resistent [MHK-Werte von ≥ 8 mg/L; Hemmhofdurchmesser von ≤ 21 mm (Staphylokokken/E. coli) und ≤ 15 mm (Streptokokken)]. Hinsichtlich des Nachweises der Methicillinresistenz, wurden die MRSA-Isolate korrekt von der empfindlichen Population unterschieden, während die MHK-Werte bei den MRKoNS-Isolaten bezüglich der vorliegenden SCCmec Kassetten und/oder Staphylococcus spp. variierten. Der derzeitige Kenntnisstand zu (i) plasmid-vermittelten Resistenzen gegenüber Proteinbiosynthese-Inhibitoren bei Staphylokokken und (ii) neuen und ungewöhnlichen Antibiotika-Resistenzgenen bei „Livestock-associated“-MRSA wurde in zwei Übersichtsartikeln dargestellt. Darüber hinaus wurden Resistenz gegenüber Apramycin sowie kombinierte Resistenz gegenüber Linkosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A-Antibiotika detailliert untersucht. Bislang waren keine Informationen zur Apramycinresistenz von Staphylokokken verfügbar. Untersuchungen an MRSA-Isolaten von Rindern (n=2), Schweinen (n=4) und Geflügelfleisch (n=1) mit Apramycin-MHKs von ≥ 32 mg/L identifizierten ein plasmidlokalisiertes Gen, apmA, das für ein Protein aus 274 Aminosäuren kodiert, welches deutliche Homologie zu Acetyltransferasen aufwies. NsiI-Deletion des apmA-Gens zeigte eine 16-32-fache Erniedrigung der Apramycin-MHKs, was bestätigte, dass dieses Gen Apramycinresistenz vermittelt. Darüber hinaus wurde eine apmA-Variante auf dem kleinen Plasmid pKKS49 von einem porzinen MRSA CC398-Isolat nachgewiesen. Untersuchungen zur kombinierten Resistenz gegenüber Linkosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A-Antibiotika identifizierten zusätzlich zu den Genen vga(A) und vga(C) das erst kürzlich beschriebene Gen vga(E) erstmalig bei MRSA CC398 von einer Puten (n=1), Rindern (n=2) und Geflügelfleisch/-produkten (n=6). Die Untersuchung der genetischen Grundlagen für erhöhte Enrofloxacin-MHK-Werte von ≥ 1 mg/L bei 21 MRSA und 15 MSSA der klonalen Komplexe CC398, CC9 und CC5 von Schweinen, Rindern, Geflügel und Geflügelfleisch/-produkten ergab Mutationen in den entsprechenden Zielgenen grlA, gyrA, grlB und/oder gyrB sowie in der Regulatorregion des Gens norA. Unabhängig von ihrer Herkunft zeigten alle CC398-Isolate eine Glu422Asp Substitution in der abgeleiteten GrlB-Sequenz und eine spezifische Kombination von Mutationen in der norA Regulatorregion, die bei den CC5- und CC9-Isolaten nicht nachweisbar waren. Außerdem wurde ein neuer Ansatz für die Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA) unter Verwendung von 16 Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Genorten, hinsichtlich der Fähigkeit getestet, 251 S. aureus-Isolate unterschiedlicher klonaler Komplexe von Menschen, Tieren und Lebensmitteln zu unterscheiden,. Insgesamt wurden 155 MLVA Typen nachgewiesen von denen 21 bei den 56 CC398-Isolaten dieser Studie zu finden waren. Darüber hinaus erwies sich der MLVA-Assay in der Lage, mitunter CC398-Isolate, die über den gleichen spa-Typ verfügten, weiter zu differenzieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Ergebnisse dieses Ph.D.-Projektes nicht nur einen umfassenden Beitrag zu den Eigenschaften methicillinresistenter Staphylokokken aus Rindermastitiden darstellen. In Teilaspekten des Ph.D.-Projektes wurden auch für die Routinediagnostik wichtige Hinweise zur korrekten Beurteilung der Methicillinresistenz bei KoNS aus boviner Mastitis und zur Interpretation der Ergebnisse der Cefoperazon-Empfindlichkeitstestung von bovinen Mastitiserregern erarbeitet. Darüber hinaus zeigt der Nachweis von neuen Resistenzgenen und deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen die Notwendigkeit von weiterer Forschung und dem Monitoring der Resistenzsituation bei MRSA CC398.