Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparative molecular analysis of methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. from cases of mastitis among dairy cattle

Feßler, Andrea Theresia

During recent years methicillin-resistance among staphylococci from humans and animals have been the focus of many studies, but only limited information on methicillin-resistance among staphylococci from bovine mastitis was available at the beginning of this Ph.D. project. The aims of this study were to comprehensively characterize bovine methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci (MRCoNS) from cases of mastitis and to compare bovine MRSA CC398 isolates with those from other sources. The genetic relationships and resistance properties of 25 bovine and two human MRSA isolates from 17 dairy farms in Germany were investigated. All isolates belonged to the clonal complex (CC) 398. Nine ApaI macrorestriction main patterns were exhibited. Three spa (t011, t034 and t2576), two SCCmec (IV, V, one isolate non-typeable) and five dru types (dt6j, dt10a, dt10q, dt11a, dt11ab) were observed. Susceptibility testing revealed ten resistance patterns. Besides the mecA gene which mediates methicillin resistance, the resistance genes blaZ (penicillins), tet(K), tet(L), tet(M) (tetracyclines), erm(A), erm(B), erm(C), erm(T) (macrolides, lincosamides, streptogramin B), aacA-aphD, aphA3, aadD (aminoglycosides), spc (spectinomycin), fexA (phenicols), dfrK (trimethoprim), vga(A) and vga(C) (pleuromutilins, lincosamides, streptogramin A) were detected. A similar situation was observed for 32 MRSA isolates from food of poultry origin, including 28 CC398 isolates with highly variable resistance pheno- and genotypes. To investigate the situation on farm level, 125 MRSA CC398 isolates from different animal species and humans from 26 Dutch dairy farms were characterized. In total, eight spa types (t011, t034, t108, t567, t1184, t1451, t2287, t3934), two SCCmec types (IV, V, and 10 non-typeable isolates), 12 resistance patterns and numerous ApaI macrorestriction patterns were observed. On the single farms different situations were seen. While indistinguishable MRSA CC398 isolates among humans and different animals were detected on some farms, different MRSA types or subtypes were present on other farms, suggesting different transmission/importation routes or the diversification of the MRSA isolates over time. Since the breakpoints for the identification of methicillin resistance among coagulase-negative staphylococci (CoNS) were adopted from human medicine, 121 isolates from bovine mastitis were tested for the correct assessment of methicillin resistance using different methods according to CLSI recommendations. The mecA gene was present in 15 of the 16 isolates phenotypically classified as resistant. Oxacillin broth micodilution classified 10 mecA-negative isolates with oxacillin MICs of 0.5 and 1 mg/L as resistant, whereas all but one isolates were classified correctly by oxacillin and cefoxitin disk diffusion. Therefore, the mecA gene or its gene product should be detected before reporting CoNS with oxacillin MICs of 0.5 and 1 mg/L as methicillin-resistant. SCCmec typing of the 15 mecA-positive MRCoNS isolates revealed SCCmec elements of types III, IV and V, while one isolate was non-typeable. These CoNS isolates were also used for a study developing a proposal for clinical breakpoints of cefoperazone, which comprised a total of 1,086 isolates from the U.S.A. and Germany, including S. aureus, CoNS, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis. Based on the cefoperazone concentrations achievable in the bovine udder, the following breakpoints were suggested: susceptible [MICs of ≤ 2 mg/L; zone diameters of ≥ 27 mm (staphylococci/E. coli) and ≥ 21 mm (streptococci)], intermediate [MICs of 4 mg/L; zone diameters of 22-26 mm (staphylococci/E. coli) and 16-20 mm (streptococci)] and resistant [MICs of ≥8 mg/L; zone diameters of for ≤ 21 mm (staphylococci/E. coli) and ≤ 15 mm (streptococci)]. Regarding the detection of methicillin resistance, all MRSA isolates were correctly separated from the susceptible population, whereas cefoperazone MICs differed among the MRCoNS with regard to the SCCmec cassette and/or the Staphylococcus spp. present. The current knowledge on (i) plasmid-mediated resistance against protein biosynthesis inhibitors among staphylococci as well as (ii) novel and uncommon antimicrobial resistance genes in livestock-associated LA-MRSA has been presented in two review articles. Moreover, resistance against apramycin and combined resistance against lincosamides, pleuromutlilins and streptogramin A have been studied in detail. So far, no information on apramycin resistance among staphylococci has been available. Studies of MRSA isolates from cattle (n=2), pigs (n=4) and food of poultry origin (n=1) with apramycin MICs of ≥ 32 mg/L identified a plasmid-borne gene, designated apmA, encoding a 274 amino acid protein with distinct homology to acetyltransferases. NsiI deletion of the apmA gene lead to a 16- to 32-fold decrease of the apramycin MICs, which confirmed that this gene mediated apramycin resistance. Moreover, an apmA-variant was detected on the small plasmid pKKS49 from a porcine MRSA ST398 isolate. Studies on the genetic basis of combined lincosamide, pleuromutilin and streptogramin A resistance identified – in addition to the genes vga(A) and vga(C) – the recently described vga(E) gene for the first time in MRSA CC398 from a turkey (n=1), cattle (n=2), and food of poultry origin (n=6). The investigation of the genetic basis of elevated enrofloxacin MICs of ≥ 1 mg/L among 21 MRSA and 15 MSSA isolates of the clonal complexes CC398, CC9 and CC5 from pigs, cattle, poultry and food of poultry origin revealed different mutations in the respective target genes grlA, gyrA, grlB and/or gyrB as well as in the regulatory region of norA. Regardless of their origin, all CC398 isolates exhibited a Glu422Asp substitution in GrlB and a specific set of norA regulator mutations that were absent in the CC5 and CC9 isolates. Moreover, a novel approach for the Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat analysis (MLVA) using 16 Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) loci was tested for its ability to discriminate 251 S. aureus (MSSA and MRSA) isolates of various clonal complexes obtained from different human, animal and food sources. In total, 155 MLVA types were identified with 21 of them being detected among the 56 CC398 isolates included in this study. Moreover, the MLVA assay was also able to occasionally further differentiate CC398 isolates that shared the same spa type. In conclusion, the results of this Ph.D. project provide not only information on the characteristics of methicillin-resistant staphylococci from bovine mastitis, but also provide guidance in routine diagnostics for the correct assessment of methicillin resistance among CoNS from cases of bovine mastitis and the interpretation of cefoperazone susceptibility testing data of bovine mastitis pathogens. Moreover, the detection of novel resistance genes and their localization on mobile genetic elements demonstrate the need of further research and monitoring of the resistance situation among MRSA CC398.

In den letzten Jahren war Methicillinresistenz bei Staphylokokken von Menschen und Tieren das Thema vieler Studien. Zu Beginn dieses Ph.D.-Projektes waren jedoch nur sehr wenige Daten zur Methicillinresistenz bei Staphylokokken aus Rindermastitiden verfügbar. Die Ziele der vorliegenden Studie waren eine umfassende Charakterisierung von bovinen methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und methicillinresistenten koagulasenegativen Staphylokokken (MRKoNS) aus Mastitisfällen sowie der Vergleich der MRSA CC398-Isolate von Rindern mit entsprechenden Isolaten anderer Herkunft. Die genetische Verwandtschaft und die Resistenzeigenschaften von 25 bovinen und zwei humanen MRSA-Isolaten aus 17 Milchviehbetrieben in Deutschland wurden untersucht. Alle Isolate gehörten zum klonalen Komplex (CC) 398. In der ApaI-Makrorestriktionsanalyse dieser Isolate zeigten sich neun Hauptmuster. Drei spa- (t011, t034 und t2576), zwei SCCmec- (IV, V, ein Isolat nicht typisierbar) und fünf dru-Typen (dt6j, dt10a, dt10q, dt11a, dt11ab) wurden nachgewiesen. Die Empfindlichkeitstestung ergab zehn Resistenzmuster. Neben dem mecA-Gen, das Methicillinresistenz vermittelt, wurden die Gene blaZ (Penicilline), tet(K), tet(L), tet(M) (Tetrazykline), erm(A), erm(B), erm(C), erm(T) (Makrolide, Lincosamide, Streptogramin B), aacA-aphD, aphA3, aadD (Aminoglykoside), spc (Spectinomycin), fexA (Phenicole), dfrK (Trimethoprim), vga(A) und vga(C) (Pleuromutiline, Lincosamide, Streptogramin A) nachgewiesen. Eine ähnliche Situation zeigte sich für ein Testkollektiv von 32 MRSA-Isolate aus Geflügelfleisch/-produkten, das 28 CC398-Isolate mit hoher Variabilität hinsichtlich der Resistenzphäno- und genotypen beinhaltete. Um die Situation auf Betriebsebene zu untersuchen, wurden 125 MRSA CC398-Isolate von verschiedenen Tierarten und Menschen aus 26 niederländischen Milchviehbetrieben charakterisiert. Insgesamt wurden acht spa-Typen (t011, t034, t108, t567, t1184, t1451, t2287, t3934), zwei SCCmec-Typen (IV, V sowie 10 nicht typisierbare Isolate), 12 Resistenzmuster und zahlreiche ApaI-Makrorestriktions-muster nachgewiesen. In den einzelnen Betrieben zeigten sich unterschiedliche Situationen. Während bei einigen Betrieben nicht-unterscheidbare MRSA CC398-Isolate bei Menschen und Tieren nachweisbar waren, deutete das Vorkommen verschiedener MRSA-Typen/Subtypen in anderen Betrieben auf verschiedene Übertragungs-/Eintragswege oder eine Veränderung der MRSA-Isolate im Laufe der Zeit hin. Da die Grenzwerte zur Beurteilung der Methicillinresistenz bei koagulasenegativen Staphylokokken (KoNS) aus der Humanmedizin stammen, wurden 121 Isolate aus Rindermastitiden, den CLSI-Vorgaben entsprechend mit unterschiedlichen Methoden hinsichtlich der korrekten Beurteilung der Methicillinresistenz getestet. Das mecA-Gen wurde bei 15 der 16 resistenten Isolate nachgewiesen. Über Oxacillin-Bouillonmikrodilution wurden 10 mecA-negative Isolate mit MHK-Werten von 0,5 und 1 mg/L als methicillinresistent beurteilt, während mittels Oxacillin- und Cefoxitin-Agardiffusion alle bis auf jeweils ein Isolat korrekt eingeteilt wurden. Daher sollten KoNS mit Oxacillin-MHK-Werten von 0,5 und 1 mg/L das mecA-Gen oder sein Genprodukt nachgewiesen werden, bevor sie als methicillinresistent klassifiziert werden. Die SCCmec-Typisierung der 15 mecA-positiven Isolate ergab SCCmec-Elemente der Typen III, IV und V, wobei ein Isolat nicht typisierbar war. Diese KoNS-Isolate wurden auch für eine Studie zur Entwicklung einer Empfehlung für klinische Grenzwerte für Cefoperazone mit verwendet, welche insgesamt 1086 Isolate aus den USA und Deutschland, einschließlich S. aureus, KoNS, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae und Streptococcus uberis, umfasste. Unter Berücksichtigung der im Rindereuter erreichbaren Cefoperazonkonzentrationen wurden die folgenden Grenzwerte vorgeschlagen: empfindlich [MHK-Werte von ≤ 2 mg/L; Hemmhofdurchmesser von ≥ 27 mm (Staphylokokken/E. coli) und ≥ 21 mm (Streptokokken)], intermediär [MHK-Werte von 4 mg/L; Hemmhofdurchmesser von 22-26 mm (Staphylokokken/E. coli) und 16-20 mm (Streptokokken)] und resistent [MHK-Werte von ≥ 8 mg/L; Hemmhofdurchmesser von ≤ 21 mm (Staphylokokken/E. coli) und ≤ 15 mm (Streptokokken)]. Hinsichtlich des Nachweises der Methicillinresistenz, wurden die MRSA-Isolate korrekt von der empfindlichen Population unterschieden, während die MHK-Werte bei den MRKoNS-Isolaten bezüglich der vorliegenden SCCmec Kassetten und/oder Staphylococcus spp. variierten. Der derzeitige Kenntnisstand zu (i) plasmid-vermittelten Resistenzen gegenüber Proteinbiosynthese-Inhibitoren bei Staphylokokken und (ii) neuen und ungewöhnlichen Antibiotika-Resistenzgenen bei „Livestock-associated“-MRSA wurde in zwei Übersichtsartikeln dargestellt. Darüber hinaus wurden Resistenz gegenüber Apramycin sowie kombinierte Resistenz gegenüber Linkosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A-Antibiotika detailliert untersucht. Bislang waren keine Informationen zur Apramycinresistenz von Staphylokokken verfügbar. Untersuchungen an MRSA-Isolaten von Rindern (n=2), Schweinen (n=4) und Geflügelfleisch (n=1) mit Apramycin-MHKs von ≥ 32 mg/L identifizierten ein plasmidlokalisiertes Gen, apmA, das für ein Protein aus 274 Aminosäuren kodiert, welches deutliche Homologie zu Acetyltransferasen aufwies. NsiI-Deletion des apmA-Gens zeigte eine 16-32-fache Erniedrigung der Apramycin-MHKs, was bestätigte, dass dieses Gen Apramycinresistenz vermittelt. Darüber hinaus wurde eine apmA-Variante auf dem kleinen Plasmid pKKS49 von einem porzinen MRSA CC398-Isolat nachgewiesen. Untersuchungen zur kombinierten Resistenz gegenüber Linkosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A-Antibiotika identifizierten zusätzlich zu den Genen vga(A) und vga(C) das erst kürzlich beschriebene Gen vga(E) erstmalig bei MRSA CC398 von einer Puten (n=1), Rindern (n=2) und Geflügelfleisch/-produkten (n=6). Die Untersuchung der genetischen Grundlagen für erhöhte Enrofloxacin-MHK-Werte von ≥ 1 mg/L bei 21 MRSA und 15 MSSA der klonalen Komplexe CC398, CC9 und CC5 von Schweinen, Rindern, Geflügel und Geflügelfleisch/-produkten ergab Mutationen in den entsprechenden Zielgenen grlA, gyrA, grlB und/oder gyrB sowie in der Regulatorregion des Gens norA. Unabhängig von ihrer Herkunft zeigten alle CC398-Isolate eine Glu422Asp Substitution in der abgeleiteten GrlB-Sequenz und eine spezifische Kombination von Mutationen in der norA Regulatorregion, die bei den CC5- und CC9-Isolaten nicht nachweisbar waren. Außerdem wurde ein neuer Ansatz für die Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA) unter Verwendung von 16 Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Genorten, hinsichtlich der Fähigkeit getestet, 251 S. aureus-Isolate unterschiedlicher klonaler Komplexe von Menschen, Tieren und Lebensmitteln zu unterscheiden,. Insgesamt wurden 155 MLVA Typen nachgewiesen von denen 21 bei den 56 CC398-Isolaten dieser Studie zu finden waren. Darüber hinaus erwies sich der MLVA-Assay in der Lage, mitunter CC398-Isolate, die über den gleichen spa-Typ verfügten, weiter zu differenzieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Ergebnisse dieses Ph.D.-Projektes nicht nur einen umfassenden Beitrag zu den Eigenschaften methicillinresistenter Staphylokokken aus Rindermastitiden darstellen. In Teilaspekten des Ph.D.-Projektes wurden auch für die Routinediagnostik wichtige Hinweise zur korrekten Beurteilung der Methicillinresistenz bei KoNS aus boviner Mastitis und zur Interpretation der Ergebnisse der Cefoperazon-Empfindlichkeitstestung von bovinen Mastitiserregern erarbeitet. Darüber hinaus zeigt der Nachweis von neuen Resistenzgenen und deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen die Notwendigkeit von weiterer Forschung und dem Monitoring der Resistenzsituation bei MRSA CC398.

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Feßler, Andrea Theresia: Comparative molecular analysis of methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. from cases of mastitis among dairy cattle. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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