Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Antigen expression and metabolism of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in vivo

Weigoldt, Mathias

Bovine Johne’s disease (paratuberculosis), caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), poses a significant economic problem to the beef and dairy industry worldwide. Also, MAP has been implicated to play a role in some cases of Crohn’s disease (CD), type 1 diabetes mellitus and multiple sclerosis in humans. Furthermore, MAP diagnostics are hampered by a lack of assays with high diagnostic sensitivity and specificity, virulence determinants and metabolism of MAP are mostly unexplored, and the pathogenesis of Johne’s disease (JD) is only partially resolved. Since mycobacterial membrane proteins expressed during infection are likely to play an important role in pathogenesis, membrane-enriched fractions, namely mucosa-derived membranes (MDM) and culture-derived membranes (CDM), of M. avium subsp. paratuberculosis from three cows with clinical paratuberculosis were investigated. In this work 48 predicted membrane proteins were identified, 13 of which have been previously associated with mycobacterial virulence (AtpF, AtpH, LprG, HBHA, SenX3, Mce, CipA, MAP2121c, MAP3305c) or the virulence of other intracellular pathogens (PepA, HtrA, SecE, MviN). Four membrane proteins (HBHA/MAP3968c, MAP0010c, MAP1775, MAP2643) and three possible membrane-associated proteins (MAP1205, MAP2057, MAP3933c) revealed higher expression in MDM compared to CDM and might play a specific role in virulence of MAP. Comparative investigation of cytoplasmic fractions (MDC vs. CDC) using high-throughput mass spectrometry (LC-MS/MS) in combination with quantitative 2D gelectrophoresis (2D DIGE) facilitated a prediction of the MAP metabolome in its natural host; predicted enzymatic functions were based on current knowledge of the Mycobacterium tuberculosis (MTB) metabolome in culture. Our results showed that, at large, the central metabolism of MAP in the host differs only slightly from that in culture. It appeared to be driven by β-oxidation of lipids, most probable host cell cholesterol. Beta-oxidation is accompanied by an alternative tricarboxylic acid pathway in which a type 2-oxoglutarate ferredoxin oxidoreductase might contribute to the conversion of a-ketoglutarate to succinyl-CoA. Carbon efflux from the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) appears to be compensated by the generation of a-ketoglutarate from glutamate via enhanced degradation of proline. Adaptation to antimicrobial host reactions is shown by enhanced expression of SodA and KatG as well as of chaperon-like proteins. Within the host, metabolism of MAP appears to be accelerated as indicted by an enhanced activity of the pentose phosphate pathway (PPP). Enhanced ATP generation through respiratory phosphorylation provides evidence for an increased demand for energy. In conclusion, this work provides for the first time a comprehensive overview of the proteome of a pathogenic mycobacterium in its natural host. In addition, the results give a highly specific picture on the metabolic adaptation of MAP in its natural host. Since MAP shares a number of virulence mechanisms with MTB and other pathogenic mycobacteria, the metabolic activities found may be common to mycobacteria in their natural hosts.

Die Johne’sche Krankheit (Paratuberkulose) wird durch Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) verursacht und führt weltweit zu erheblichen ökonomischen Verlusten in Fleisch- und Milchindustrie. Außerdem wird vermutet dass MAP in einigen Fällen von Morbus Crohn, Diabetis Mellitus Typ 1 und Multiple Sklerose beim Menschen beteiligt ist. Zudem ist der diagnostische MAP Nachweis aufgrund nicht ausreichend spezifischer und sensitiver Nachweisverfahren erschwert. Des Weiteren sind Virulenzfaktoren und Stoffwechsel von MAP weitgehend unerforscht und die Pathogenese der Johne’schen Krankheit nur teilweise aufgeklärt. Da die Expression mykobakterieller Membranproteine während des Infektionsgeschehens wahrscheinlich für den Krankheitsverlauf eine bedeutende Rolle spielt, wurden Membranfraktionen von MAP aus Darmmukosa (MDM) und MAP-Kultur (CDM) von drei klinisch erkrankten Kühen mit Paratuberkulose untersucht. Dabei wurden 48 Proteine mit vorhergesagter Membranlokalisation identifiziert von denen 13 bereits mit mykobakterieller Virulenz (AtpF, AtpH, LprG, HBHA, SenX3, Mce, CipA, MAP2121c, MAP3305c) oder der Virulenz anderer intrazellulärer Krankheitserreger (PepA, HtrA, SecE, MviN) in Zusammenhang gebracht wurden. Vier Membranproteine (HBHA/MAP3968c, MAP0010c, MAP1775, MAP2643) und drei vermutlich membranassoziierte Proteine (MAP1205, MAP2057, MAP3933c) wurden in MDM stärker als in CDM exprimiert nachgewiesen und könnten demnach eine spezifische Bedeutung als MAP-Virulenzfaktor haben. Eine vergleichende Untersuchung der zytoplasmatischen Fraktionen (MDC vs. CDC) mittels Hochleistungsmassenspektrometrie (LC-MS/MS) in Kombination mit quantitativer 2D Gelelektrophorese (2D DIGE) ermöglichte Vorhersagen des MAP Metaboloms in seinem natürlichen Wirt; dabei basierten die vorhergesagten Enzymfunktionen auf aktuellen Erkenntnissen zum Mycobacterium tuberculosis (MTB) Metabolom in Kultur. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich zentrale Stoffwechselwege von MAP im Wirt nur geringgradig von denen in Kultur unterscheiden. Der Kohlenstoffmetabolismus scheint durch β-Oxidation von Lipiden, höchstwahrscheinlich Wirtszellen Cholesterol, gespeist zu werden. Die Beta-Oxidation von Lipiden wird durch einen alternativen Stoffwechselweg des Tricarbonsäurezyklus (TCA) begleitet, wobei eine Typ 2-Oxoglutarat Ferredoxin Oxidoreduktase an der Umsetzung von a-Ketoglutarat zu Succinyl-CoA beteiligt sein könnte. Der Kohlenstoffabfluss vom TCA scheint durch die Erzeugung von a-Ketoglutarat aus Glutamat durch erhöhten Abbau von Prolin kompensiert zu werden. Die Anpassung an antimikrobielle Wirtsabwehr zeigte sich durch eine erhöhte Expression von SodA und KatG sowie von Chaperon-ähnlichen Proteinen. Innerhalb des Wirts scheint der Metabolismus von MAP beschleunigt zu sein; dies wird durch eine erhöhte Aktivität des Pentose-Phosphat-Wegs (PPP) angedeutet. Eine erhöhte ATP-Bildung mittels oxidativer Phosphorylierung liefert den Hinweis auf einen erhöhten Energiebedarf. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit somit erstmalig ein zusammenfassender Überblick über das Proteom und die Stoffwechselwege eines pathogenen Mycobakteriums im natürlichen Wirt erarbeitet. Weiterhin zeichnen die Ergebnisse ein hochspezifisches Bild von der Anpassung des Stoffwechsels im natürlichen Wirt. Da MAP und andere pathogene Mykobakterien über eine große Zahl gemeinsamer Virulenzmechanismen verfügen, könnten die identifizierten Stoffwechselaktivitäten eine allgemeine Bedeutung für Mykobakterien in ihrem natürlichen Wirt besitzen.

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Weigoldt, Mathias: Antigen expression and metabolism of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in vivo. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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