Antigen expression and metabolism of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in vivo

Die Johne’sche Krankheit (Paratuberkulose) wird durch Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) verursacht und führt weltweit zu erheblichen ökonomischen Verlusten in Fleisch- und Milchindustrie. Außerdem wird vermutet dass MAP in einigen Fällen von Morbus Crohn, Diabetis Mellitus Typ 1 und Multiple Sklerose beim Menschen beteiligt ist. Zudem ist der diagnostische MAP Nachweis aufgrund nicht ausreichend spezifischer und sensitiver Nachweisverfahren erschwert. Des Weiteren sind Virulenzfaktoren und Stoffwechsel von MAP weitgehend unerforscht und die Pathogenese der Johne’schen Krankheit nur teilweise aufgeklärt. Da die Expression mykobakterieller Membranproteine während des Infektionsgeschehens wahrscheinlich für den Krankheitsverlauf eine bedeutende Rolle spielt, wurden Membranfraktionen von MAP aus Darmmukosa (MDM) und MAP-Kultur (CDM) von drei klinisch erkrankten Kühen mit Paratuberkulose untersucht. Dabei wurden 48 Proteine mit vorhergesagter Membranlokalisation identifiziert von denen 13 bereits mit mykobakterieller Virulenz (AtpF, AtpH, LprG, HBHA, SenX3, Mce, CipA, MAP2121c, MAP3305c) oder der Virulenz anderer intrazellulärer Krankheitserreger (PepA, HtrA, SecE, MviN) in Zusammenhang gebracht wurden. Vier Membranproteine (HBHA/MAP3968c, MAP0010c, MAP1775, MAP2643) und drei vermutlich membranassoziierte Proteine (MAP1205, MAP2057, MAP3933c) wurden in MDM stärker als in CDM exprimiert nachgewiesen und könnten demnach eine spezifische Bedeutung als MAP-Virulenzfaktor haben. Eine vergleichende Untersuchung der zytoplasmatischen Fraktionen (MDC vs. CDC) mittels Hochleistungsmassenspektrometrie (LC-MS/MS) in Kombination mit quantitativer 2D Gelelektrophorese (2D DIGE) ermöglichte Vorhersagen des MAP Metaboloms in seinem natürlichen Wirt; dabei basierten die vorhergesagten Enzymfunktionen auf aktuellen Erkenntnissen zum Mycobacterium tuberculosis (MTB) Metabolom in Kultur. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich zentrale Stoffwechselwege von MAP im Wirt nur geringgradig von denen in Kultur unterscheiden. Der Kohlenstoffmetabolismus scheint durch β-Oxidation von Lipiden, höchstwahrscheinlich Wirtszellen Cholesterol, gespeist zu werden. Die Beta-Oxidation von Lipiden wird durch einen alternativen Stoffwechselweg des Tricarbonsäurezyklus (TCA) begleitet, wobei eine Typ 2-Oxoglutarat Ferredoxin Oxidoreduktase an der Umsetzung von a-Ketoglutarat zu Succinyl-CoA beteiligt sein könnte. Der Kohlenstoffabfluss vom TCA scheint durch die Erzeugung von a-Ketoglutarat aus Glutamat durch erhöhten Abbau von Prolin kompensiert zu werden. Die Anpassung an antimikrobielle Wirtsabwehr zeigte sich durch eine erhöhte Expression von SodA und KatG sowie von Chaperon-ähnlichen Proteinen. Innerhalb des Wirts scheint der Metabolismus von MAP beschleunigt zu sein; dies wird durch eine erhöhte Aktivität des Pentose-Phosphat-Wegs (PPP) angedeutet. Eine erhöhte ATP-Bildung mittels oxidativer Phosphorylierung liefert den Hinweis auf einen erhöhten Energiebedarf. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit somit erstmalig ein zusammenfassender Überblick über das Proteom und die Stoffwechselwege eines pathogenen Mycobakteriums im natürlichen Wirt erarbeitet. Weiterhin zeichnen die Ergebnisse ein hochspezifisches Bild von der Anpassung des Stoffwechsels im natürlichen Wirt. Da MAP und andere pathogene Mykobakterien über eine große Zahl gemeinsamer Virulenzmechanismen verfügen, könnten die identifizierten Stoffwechselaktivitäten eine allgemeine Bedeutung für Mykobakterien in ihrem natürlichen Wirt besitzen.