Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Functional properties of ion channels and transporters contributing to the synaptic inhibition in the mammalian central nervous system

Song, Yunping

Neurotransmission is a complex process modulated by various ion channels and amino acid transporters. Activation of post-synaptic inhibitory ligand-gated ion channels such as glycine or GABAA receptors directly triggers the inhibitory neurotransmission, while excitatory amino acid transporters indirectly potentiate the inhibitory effect by clearing the excitatory neurotransmitters from the post-synaptic and extra-synaptic region. The integration and coordination of various electrochemical signals in the network of the synaptic inhibition is essential for the human physiology. In this study, we characterized various factors (mutation, extracellular pH and neurosteroids) influencing the functions of excitatory amino acid transporters (EAAT2 and EAAT4) and inhibitory ligand-gated ion channels (glycine and GABAA receptors) in the CNS. We conclude that: 1) charge neutralization of a conserved aspartic acid residue in the TM8 induces profound changes in EAAT2 and EAAT4. Glutamate acts as an inhibitor of both mutations. Kinetic analysis confirmed the impaired interaction of Na+ with empty transporters. We also simulated the mechanism of EAAT2D486N by using an established computational model. With internal K+, mutant transporters accumulate in ‘To’ state, which has a very low anion channel open probability; with internal Na+ or glutamate, wild-type and mutant transporters share the similar distribution of transport states, with majority of them trapped in ‘TiNa2’ states. The reduced anion channel opening rate of the ‘TiNa2’ state in mutant transporters accounts for the smaller current observed under these conditions. 2) Extracellular pH fluctuations inhibit the glycinergic currents. The trend of an accelerated current desensitization was observed when the pH was shifted 1 unit from the neutralized value. Stronger acidic conditions induce more pronounced effect, with significant faster desensitization, significant reduced relative area-under-current curve (rAUC) and relative current amplitude of steady state (rCdes). Hetermoric a1b glycine receptors show a less sensitivity to the inhibitory effects by changed pH values compared to homomeric ones. 3) Neurosteroids androsterone and progesterone act as allosteric modulators for glycine and GABAA receptors. Overall, effects of androsterone are more pronounced on GABAA receptors than on glycine receptors. Androsterone (1- 100 µM) even can directly activate the GABAA receptors. Progesterone (100 µM) alone induces a slight response on α1b glycine receptor channels and on a1b2g2 GABAA receptors. Significantly potentiating effects of androsterone and progesterone were observed on both GABAA and glycine receptors. Biphasic dose-response dependency indicates at least two distinct binding sites for neurosteroids are localized on these ligand-gated channels.

Die inhibitorische Neurotransmission ist ein komplexes System aus  unterschiedlichsten Kanälen und Transportern, die verschiedensten Regulationsmechanismen unterliegen. Aktivierung post-synaptischer ligandengesteuerter Ionenkanäle wie Glyzin- oder GABAA-Rezeptoren steuert die inhibitorische Neurotransmission direkt, während exzitatorische Aminosäuretransporter den inhibitorischen Effekt indirekt unterstützen, indem sie exzitatorische Neurotransmitter aus post- und extra-synaptischen Regionen beseitigen. Für ein geregeltes Funktionieren des menschlichen Körpers sind die hier untersuchten Membranproteine unabdingbar. 1) In diesen Untersuchungen charakterisierten wir den Einfluss verschiedener Faktoren (Mutationen, extrazellulären pH und Neurosteroide) auf die Funktionen der exzitatorischen Aminosäuretransporter EAAT2 und EAAT4, als auch auf die inbitorischen, ligandengesteuerten Ionenkanäle Glyzin- und GABAA-Rezeptor. Ladungsneutralisierung eines konservierten Aspartats in TM8 erzeugt profunde Änderungen in EAAT2 und EAAT4. Glutamat agiert als Inhibitor bei beiden Mutationen. Analysen der Kinetik bestätigten die verhinderte Interaktion von Na+-Ionen mit den leeren Transportern. Zusätzlich simulierten wir diesen Mechanismus mit einem etablierten Model für D486N EAAT2. Durch internes K+ wird die Mehrzahl der Transporter in den ´To´-Zustand versetzt, der eine sehr kleine Offenwahrscheinlichkeit aufweist; bei internem Na+ oder Glutamat werden WT als auch mutierte Transporter vornehmlich in den ´TiNa2´-Zustand versetzt. Die verminderte Öffnungsrate des ´TiNa2´-Zustands der mutierten Transporter ist verantwortlich für die beobachteten, kleineren Ströme unter diesen Bedingungen. 2) Extrazelluläre pH-Schwankungen verhindern glyzinerge Ströme. Die Tendenz einer beschleunigten Desensibilisierung des Stromes kann bei einer Verschiebung des pH´s um eine Einheit von dem neutralisierenden Wert beobachtet werden. Der Effekt wird durch weitere Ansäuerung verstärkt, d.h. eine signifikant schnellere Desensibilisierung kann beobachtet werden, ebenso wie eine signifikant verminderte relative Fläche-unter-Strom-Kurve und verminderten relativen Stromamplitude der stationären Phase. Heteromere a1b Glyzinrezeptoren zeigen eine geringere pH-Empfindlichkeit verglichen mit den homodimeren Rezeptoren. 3) Die Neurosteroide Androsteron und Progesteron fungieren als allosterische Modulatoren für Glyzin und GABAA-Rezeptoren, wobei die Androsteron-Effekte auf GABAA-Rezeptoren stärker ausfallen, als die auf Glyzin-Rezeptoren. Androsteron (100 µM) kann GABAA-Rezeptoren sogar direkt aktivieren. Progesteron (100 µM) induziert eine leichte Antwort der α1b Glyzin- und α1b2g2 GABAA-Rezeptoren. Signifikant verstärkende Effekte von Androsteron und Progesteron auf GABAA- und Glyzin-Rezeptoren konnten beobachtet werden. Biphasische Dosis-Wirkungs-Beziehung deutet auf zwei unterschiedliche Bindestellen für diese Neurosteroide hin.

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Song, Yunping: Functional properties of ion channels and transporters contributing to the synaptic inhibition in the mammalian central nervous system. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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