Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern ("Multidrug-Transportern") durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und deren Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke verschiedener Spezies

Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al. 2006), weshalb eine wirksame Behandlung von großem Interesse ist. Die Patienten werden vorrangig mit Antiepileptika therapiert. Diese Medikamente zeigen aber bei etwa einem Drittel der Patienten nur eine unzureichende oder gar keine Wirkung (KWAN & BRODIE 2000). Es ist bis heute unklar, wodurch das Phänomen der Pharmakoresistenz ausgelöst wird. Ein viel diskutierter Ansatz ist die Multidrug-Transporter-Hypothese. Dieser zufolge führt eine Überexpression sogenannter Multidrug-Transporter (MDT) an der Bluthirnschranke (BHS) zu einem vermehrten Efflux der Antiepileptika zurück ins Blut, weshalb nur unzureichende Konzentrationen im epileptischen Fokus erreicht werden. Erste Zusammenhänge zwischen einer Hochregulierung solcher Transporter und der Pharmakoresistenz zeigten die Studien von TISHLER et al. (1995), die den gut untersuchten Transporter P-Glykoprotein (Pgp) in epileptischem Hirngewebe nachwiesen. Des Weiteren erbrachten Studien den Nachweis, dass Pgp eine Reihe der therapeutisch eingesetzten Antiepileptika transportiert (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009), wodurch niedrige Konzentrationen im Gehirn ebenfalls zu erklären sind. Dieser Transport wurde bisher nur für Phenytoin in Kapillarendothelzellen humanen Ursprungs untersucht (CUCULLO et al. 2007), weshalb in der vorliegenden Arbeit die immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-Modell eingesetzt wurde. Mit dieser Zelllinie sollte geklärt werden, ob der Transport von Antiepileptika durch Pgp nachgewiesen werden kann. Immortalisierte Endothelzellen gelten allerdings aufgrund einer unzureichenden Integrität der Zellmonolayer als ungeeignet für Transportstudien (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005). Aus diesem Grund wurden zusätzlich Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte präpariert. Diese wurden im Transwell-Modell eingesetzt, um deren Eignung und Pgp-spezifischen Transport untersuchen zu können. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der MDT-Hypothese, der damit verbundenen Überexpression der MDT sowie der Etablierung einer humanen Zelllinie als Transwell-Modell. Von besonderem Interesse war dabei das Pgp. Es ist nicht hinreichend geklärt, wodurch eine verstärkte Funktion dieser Transporter bei epileptischen Patienten ausgelöst wird. Ziel der Untersuchungen war es herauszufinden, ob Antiepileptika die Funktionalität von Pgp induzieren. Dazu wurde die humane Zelllinie hCMEC/D3 ausgewählt. Bei hCMEC/D3-Zellen handelt es sich um immortalisierte Endothelzellen aus dem Temporallappen einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin (WEKSLER et al. 2005). Die hCMEC/D3-Zellen exprimieren für Endothelien typische Marker-proteine und werden für In-vitro-Untersuchungen eingesetzt (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In vorläufigen Studien wurden auch primäre Hirnkapillarendothelzellen der Ratte eingesetzt. Der Western Blot ermöglichte den Nachweis von Pgp sowohl in den immortalisierten hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen als auch in den primären Hirnendothelien der Ratte. Die funktionelle Untersuchung wurde mit Hilfe von Kumulations-Assays mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 durchgeführt. Dazu wurden hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen mit den Antiepileptika Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat behandelt. In den Primärkulturen wurden Carbamazepin und Phenytoin untersucht. Die Behandlung erstreckte sich i.d.R. über drei Tage. Im Kumulations-Assay konnte für alle Zelllinien und den primären rBCEC-Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden, dessen Funktion durch bekannte Induktoren und den spezifischen Inhibitor Tariquidar moduliert werden konnte. Dabei zeigten die hCMEC/D3-Zellen funktionelles Pgp, welches sich trotz vergleichsweise geringer Expression nur schwer induzieren ließ. Die Ergebnisse der Kumulations-Assays variierten in den Zellen der verschiedenen Spezies. Die Funktionalität von Pgp wurde nicht von allen Antiepileptika in den gewählten Konzentrationen beeinflusst. Das heißt, dass die getesteten Antiepileptika nicht in allen Zellen induzierende Wirkungen hatten. Die robustesten Effekte in hCMEC/D3-Zellen ließen sich mit Carbamazepin (100 µM) und Valproat (300 µM) zeigen. In RBE4-Zellen induzierte Carbamazepin (50 µM) die Funktionalität Pgps. In den Versuchen mit rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin zu einer Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere Konzentrationen der Antiepileptika untersucht werden, um mögliche konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden. Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell-Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol-Permeabilitäten zeigte. Demzufolge führte die Kokultur dieser Gliazellen mit den Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et al. 2002) könnten dazu beitragen, gezielte In-vitro-Untersuchung des Transports von Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen.