Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die morphologische und molekulare Qualität in vitro produzierter boviner Embryonen

Das Ziel der vorliegenden Studie war es den Einfluss zweier Vitrifikationsmedien auf die morphologische und molekulare Qualität boviner, in vitro generierter Embryonen zu untersuchen. Die Vitrifikation und das Auftauen von an Tag 7 expandierten Blastozysten, die aus einem Standard-IVP-System (SOFaa) stammten, erfolgte entweder mit einem Vitrifikationskit das unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthielt (V1, n=142; Gynemed, Lehnsahn, Deutschland), oder mit einem Kit, welches kein DMSO enthielt (V2, n=151; Origio, Berlin, Deutschland). Embryonen, die zwei weiteren Gruppen zugeordnet wurden, hatten nur Kontakt mit den jeweiligen Einfrier‑ respektive Auftaumedien, ohne tatsächlich kryokonserviert worden zu sein (KV1 - Kontakt zum DMSO-haltigen Medium der Firma Gynemed, n=107; KV2 - Kontakt zum DMSO-freien Medium der Firma Origio, n=97). Nach der Vitrifikation und dem Auftauen erfolgten weitere 48 Stunden der Kultur, um nach 24 bzw. 48 Stunden die Reexpansions- und Schlupfraten zu ermitteln. Die Analyse der geschlüpfte Blastozysten der jeweiligen Gruppen erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung oder einer RT-qPCR. In der molekularen Analyse wurde die relative Transkriptmenge von SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 und PTGS2 bestimmt. Als Standard dienten für diese Analysen nicht vitrifizierte, geschlüpfte Blastozysten (K), die weder Kontakt zu den Vitrifikationsmedien hatten noch eingefroren wurden. Die folgenden Ergebnisse konnten erzielt werden: 1.      Die in den versuchen eingesetzten Blastozysten entstammen 26 IVP‑Durchgängen. Die durchschnittliche Teilungsrate betrug 61,1 ± 6,2% (n = 2990). Die Entwicklungsrate bis zur Morula oder Blastozyste lag an Tag 7 bei 18,6 ± 4,8% (n = 906) und an Tag 8 bei 25,9 ± 6,1% (n = 1275). 2.      Nach dem Auftauen lag die Reexpansionsrate für die expandierten Blastozysten der V1-Gruppe bei 89,2 ± 5,3%, die der V2-Gruppe bei 67,0 ± 15,5%. Die Schlupfrate lag bei 62,9 ± 12,2% für die Embryonen der V1- und bei 29,4 ± 14,5% für die Embryonen der V2-Gruppe. Die Reexpansionsraten der Embryonen der KV1- bzw. der KV2-Gruppe lagen bei 90,0 ± 8,2% und 90,0 ± 15,4%, die Schlupfraten bei 69,2 ± 12,0% und 47,9 ± 17,8%. Es konnte eine statistisch signifikante Reduzierung der Reexpansions- und Schlupfrate der Embryonen der V2-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt werden. Des Weiteren konnte eine Reduzierung der Schlupfrate der KV2-Blastozysten im Vergleich zu den Blastozysten der KV1-Gruppe festgestellt werden. 3.      Die durchschnittliche Zellzahl lag bei den Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen bei 119,8 ± 5,8 in der V1-Gruppe (n = 25), 123,5 ± 4,0 in der V2‑Gruppe (n = 20), 120,6 ± 4,8 in der KV1-Gruppe (n = 25), 119,0 ± 5,0 in der KV2‑Gruppe (n = 25) und 116,7 ± 4,8 in der Kontrollgruppe (n = 24). Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamtzellzahl der geschlüpften Blastozysten zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Die Lebend‑Tot‑Zellratio war bei den Embryonen der V2-Gruppe (7,8 ± 0,8) statistisch signifikant niedriger als die der V1-Gruppe (12,5 ± 0,9), der KV1-Gruppe (15,6 ± 2,1), der KV2-Gruppe (13,1 ± 1,0) und der Kontrollgruppe (17,0 ± 2,0). 4.      Die Analyse der relativen Transkriptmengen von IFNT2 und PTGS2 ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Embryonen der einzelnen Gruppen. 5.      Die Expression von SLC2A1 war in den Embryonen der V1-Gruppe signifikant niedriger als in den Embryonen der KV1- und der Kontrollgruppe. 6.      Bei der Analyse der Blastozysten der Gruppen V1 und KV2 konnten signifikant weniger TJP1-Transkripte nachgewiesen werden als in denen der Kontrollgruppe. Tendenziell waren in den Embryonen der V2-Gruppe ebenfalls weniger TJP1‑Transkripte als in den Embryonen der Kontrollgruppe darstellbar. 7.      Blastozysten, die nach dem KV2- oder dem V1-Protokol behandelt wurden, wiesen eine geringere Menge an DSC2-Transkripten auf als die Blastozysten der anderen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe. 8.      Die Expression von HSPA1A war in den Embryonen der V1-Gruppe statistisch signifikant niedriger als in denen der Kontrollgruppe, der V2- und der KV1-Gruppe. Die Transkriptmenge der Embryonen der KV2-Gruppe war signifikant niedriger als die der Embryonen der V2- und der KV1-Gruppe, unterschied sich jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht. Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass die Vitrifikation durch Medien, welche unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthalten, auf morphologischer Ebene zu einer besseren Überlebensfähigkeit nach dem Auftauen führt. Die Embryonen zeigen jedoch Veränderungen auf molekularer Ebene. Bei vier der sechs untersuchten, entwicklungsrelevanten Gentranskripte konnte eine verringerte Qualität im Vergleich zu den Embryonen der DMSO-freien Gruppen festgestellt werden. Inwiefern sich diese molekularen Unterschiede auf die Überlebensfähigkeit und die Gesundheit von Kälbern auswirken, müsste in weiteren Untersuchungen ermittelt werden.