The isolated perfused equine distal limb and synoviocyte cultures as models for pharmacological studies

Ziel der vorliegenden PhD-Arbeit war es, geeignete Modelle zur Untersuchung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Daten von Substanzen zu etablieren, mit denen beim Pferd Gelenksbehandlungen durchgeführt werden. Um zunächst die Verteilung von Stoffen nach intra-artikulärer oder systemischer Applikation zu untersuchen, wurde das ex vivo Modell des isoliert perfundierten distalen Pferdebeins etabliert. Vordergliedmaßen von Pferden wurden an einem Schlachthof im Karpalgelenk exartikuliert und innerhalb von 1 h nach der Schlachtung über die A. mediana mit oxygenierter Tyrodelösung, die Natrium-Carboxymethylcellulose enthielt, bei einer Flussrate von ca. 65 ml/min für 8 Stunden perfundiert. Die Gewebevitalität während der Perfusion wurde durch die Bestimmung von Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und LDH-Freisetzung im venösen Perfusat der V. radialis überprüft. Des Weiteren wurden Hautoberflächentemperatur und Gewichtszunahme als Indikatoren für periphere Blutversorgung und Ödembildung kontrolliert. Die Unversehrtheit der Gelenkkapsel wurde mittels histologischer Untersuchung beurteilt. Mindestanforderungen für eine ausreichende Vitalität der distalen Gliedmaße wurden formuliert. Die Abflutung von Betamethason über die V. radialis nach intra-artikulärer Injektion von BMdihydrogenphosphat-Dinatrium (4 mg BM) ins Fesselgelenk wurde mittels HPLC und UV-Detektion gemessen (n=6). Die durchschnittliche BM-Abflutung pro Minute betrug 5.1 µg/min, mit Werten zwischen 9 µg/min und 2.9 µg/min. 7.5 Stunden nach i.a.-Applikation waren 2.3 mg BM aus dem Gelenk abgeflutet. Die Distribution von Acetylsalicylsäure und ihres Metaboliten Salicylsäure in das Fesselgelenk nach systemischer Applikation von ASA wurde ebenfalls am isoliert perfundierten Pferdebein untersucht (n=8). Plasmakonzentrationen von ASA und SA wurden aus einer entsprechenden in vivo Studie übernommen und dem Perfusat zugesetzt (BROOME et al. 2003). Ihre Konzentrationen in der Synovialflüssigkeit wurden mit einer kalibrierten Mikrodialysesonde und HPLC-UV bestimmt. Zwei Beine wurden mit verdünntem autologem Blut perfundiert, um eine Orientierung hinsichtlich des Einflusses der Plasmaproteinbindung zu erhalten. In den Tyrode-perfundierten Gliedmaßen (n=6) wurden maximale synoviale Konzentrationen von 2.1x10-5 mol/l (ASA) und 1.27x10-4 mol/l (SA) erreicht. Die Salicylatkonzentration in der Synovialflüssigkeit der hämoperfundierten Beine war ca. 50 % niedriger, wahrscheinlich aufgrund der Plasmaproteinbindung der Salicylate von 50 %. Die Abnahme von ASA und SA in der Synovia verlief bedeutend langsamer als im Plasma, was für eine Akkumulation im Gelenk spricht. Um im Anschluss die antiphlogistische Wirkung der im isoliert perfundierten Pferdebein gemessenen Synovialkonzentrationen einzuordnen, wurde ein primäres Zellkulturmodell aus equinen Synoviozyten etabliert. Die aus makroskopisch gesunden Fesselgelenken (n=6) isolierten Zellen wurden mit LPS stimuliert und mit abnehmenden Konzentrationen von BM, ASA und SA behandelt. Die Inhibition der Prostaglandin E2-Produktion im Vergleich mit einer unbehandelten Kontrolle wurde als Indikator für einen entzündungshemmenden Effekt verwendet. Die niedrigsten Konzentrationen, die zu einer signifikanten Hemmung der PGE2-Produktion führten, betrugen 2.55x10-9 mol/l für BM und 7.77x10-6 mol/l für ASA. Die eingesetzten SA-Konzentrationen führten nicht zu einer signifikanten PGE2-Hemmung. Die Ergebnisse bedeuten einen Hinweis darauf, dass die entzündungshemmende Wirkung im Gelenk im Vergleich zum Plasma länger andauert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das isoliert perfundierte Pferdebein und die Synoviozytenkultur erfolgreich etabliert werden konnten. Ohne dass Versuchspferde eingesetzt werden, ermöglichen sie die Untersuchung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Charakteristika von Substanzen,  die für die Gelenksbehandlung beim Pferd eingesetzt werden.