Investigation of immunomodulatory properties of neurovirulent viruses
Die Infektion mit dem Hundestaupevirus (canine distemper virus, CDV) führt bei Hunden zu einer fieberhaften Erkrankung mit respiratorischen, enteralen und zentralnervösen Symptomen. Vergleichbar mit der Masernvirusinfektion des Menschen entwickelt sich in der akuten Phase der Hundestaupe außerdem eine Depletion sämtlicher lymphatischer Organe mit daraus resultierender Leukopenie und Immunsuppression. In Abhängigkeit vom Immunstatus und Alter des Hundes sowie vom Virusstamm entwickelt sich eine demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis, welche Ähnlichkeiten mit den Läsionen bei der Multiplen Sklerose (MS) aufweist. Die Hundestaupe stellt daher ein translationales Tiermodell für humane Entmarkungskrankheiten dar. Regulatorische T-Zellen (regulatory T cells, Treg) führen einerseits zu einer Reduktion immunpathologischer Prozesse, andererseits konnte insbesondere bei viralen Infektionen des Zentralen Nervensystems (ZNS) eine Hemmung der protektiven Immunität und damit eine Exazerbation der Krankheit beobachtet werden. Die Bedeutung von Treg im Verlauf der CDV-Infektion ist bislang unklar. Außerdem ist die Rolle der Dendritischen Zellen (DZ) für die Pathogenese der Hundestaupe bisher nur unzureichend untersucht worden. Das Ziel des ersten Teils der Arbeit war die Überprüfung der Hypothese, dass eine Treg-Depletion in peripheren lymphatischen Organen zu einer gestörten Immunmodulation im Gehirn von CDV-infizierten Hunden führt. Mittels Immunhistologie konnte ein Verlust von Foxp3+Treg in Verbindung mit einer Ansammlung von CD3+ T-Zellen, L1+Makrophagen/Mikroglia und GFAP+Astrozyten in prädemyelinisierenden und frühen demyelinisierenden Herden im ZNS von infizierten Hunden nachgewiesen werden. Gemeinsam mit CD79α+ B-Zellen konnte eine verzögerte Infiltration von Foxp3+Treg in der chronischen Entmarkungsphase festgestellt werden. Die Depletion von Foxp3+Treg in der Milz war mit einer vermehrten mRNS-Expression des Tumor-Nekrose-Faktors vergesellschaftet. Die Ergebnisse sprechen für das Vorliegen einer gestörten Immunregulation in peripheren lymphatischen Organen und dem ZNS, welche zu einer exzessiven Neuroinflammation und möglicherweise Initiation der Gehirnläsionen führt. Vergleichbare Vorgänge werden gegenwärtig für die Pathogenese der MS diskutiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden in einem Übersichtsartikel tierartspezifische und translationale Aspekte von kaninen DZ zusammengefasst und die Rolle der Zellen in neoplastischen, infektiösen (inklusive Hundestaupe), allergischen und autoimmunen Krankheiten des Hundes diskutiert. Ein Schwerpunkt war hierbei, Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen kaninen und humanen Krankheiten aufzuzeigen. Im dritten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des CDV auf professionell antigenpräsentierende Zellen näher untersucht. Hintergrund hierbei war die Beobachtung, dass, vergleichbar mit den Prozessen bei der Masernvirusinfektion, CDV eine Differenzierungsstörung von DZ hervorruft und dadurch eine verminderte Antigenpräsentation und Lymphozytenaktivierung bei Hunden ausgelöst wird. Zur Überprüfung wurden Monozyten aus dem Blut von klinisch gesunden Hunden isoliert, in Kultur zu DZ differenziert und anschließend mit CDV infiziert. Die Infektion der DZ wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie verifiziert und der Virusgehalt mittels Immunfluoreszenz und Virustitration quantifiziert. Außerdem wurden durchflusszytometrische Analysen durchgeführt. Zelluläre Schäden wurden mittels der terminal desoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)-Methode und dem Laktatdehydrogenase (LDH)-Test ermittelt. Der Bromdesoxyuridin (BrdU)-Test wurde zur Quantifizierung der Zellproliferation in vitro eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Zunahme der Infektionsrate 24, 72 und 120 Stunden nach der Infektion (hours post infection, hpi). Mittels Durchflusszytometrie konnte eine verminderte Expression der ko-stimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 sowie des MHC II in infizierten DZ nachgewiesen werden. Als möglicher Persistenzmechanismus zeigten die Zellen 24, 72 und 120 hpi keine gesteigerte Apoptose (TUNEL-Methode) bzw. Lyse (LDH-Test). Außerdem blieb die Proliferation infizierter Zellen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen mittels BrdU-Test an allen Untersuchungszeitpunkten unverändert. Die Daten sprechen für das Vorliegen einer virusinduzierten Störung der Ko-stimulation bzw. Antigenpräsentation von DZ. Außerdem besitzt das CDV die Eigenschaft potentiell in kaninen DZ zu persistieren. Die Ergebnisse der Studien unterstützen die Hypothese einer gestörten Immunregulation im Zusammenhang mit dem Verlust von Treg, wodurch eine unkontrollierte Entzündungsreaktion im ZNS von CDV-infizierten Tieren ausgelöst wird. Außerdem ist möglicherweise die Infektion von DZ für die lang andauernden Alterationen des Immunsystems bei der Hundestaupe mitverantwortlich. In diesem Zusammenhang haben neuere Untersuchungen gezeigt, dass die Neuroinflammation bei Entmarkungskrankheiten maßgeblich durch eine gestörte Immunhomöostase in peripheren lymphatischen Organen beeinflusst wird. Techniken zur Modulation von Treg und DZ stellen daher innovative Therapieansätze für neurologische Krankheiten in der Human- und Tiermedizin dar.
Distemper in dogs is caused by the canine distemper virus (CDV). The disease course and pathogenesis of canine distemper are similar to human measles, including fever, rash, respiratory signs, lymphopenia, and profound immunosuppression with generalized depletion of lymphoid organs during the acute disease phase. Central nervous system (CNS) infection and neurological complications can be observed frequently in infected dogs. Depending on CDV strain, host immune status and age, naturally infected dogs develop demyelinating leukoencephalomyelitis, which shares similarities with human myelin disorders. Therefore canine distemper is appreciated as a translational animal model for multiple sclerosis (MS). In virus-induced neurological diseases, an ambiguous function of regulatory T cells (Treg), with both beneficial effects by reducing immunopathology and detrimental effects by inhibiting antiviral immunity, has been described. However, the role of Treg in the pathogenesis of canine distemper has not been investigated yet. Moreover, despite the demonstration of infected dendritic cell (DC)-like cells in canine distemper, the effect of CDV upon canine DCs remains undetermined. The aim of the first part of the present study was to testify the hypothesis that peripheral lymphoid depletion influences immunomodulatory mechanisms in the brain of CDV-infected dogs. Immunohistochemistry revealed a lack of Foxp3+ Treg in predemyelinating and early demyelinating lesions which was associated with the accumulation of CD3+ T cells, L1+ macrophages/microglia and GFAP+ astrocytes. Together with CD79α+ B cells, a delayed infiltration of Foxp3+ Treg was observed in chronic demyelinating lesions. Splenic depletion of Foxp3+ Treg was associated with an increased mRNA-expression of tumor necrosis factor in the acute disease phase, indicative of a pro-inflammatory microenvironment and lack of immunological counter regulation in peripheral lymphoid organs. In conclusion, disturbed immune regulatory mechanisms represent a potential cause for excessive neuroinflammation and early lesion development in canine distemper leukoencephalitis, as discussed for immune mediated myelin disorders such as MS. In the second part of the thesis species-specific properties and translational aspects of canine DCs have been reviewed, including the current knowledge about in vitro generation and characterization of canine DCs. In addition, the role of DCs in the pathogenesis of selected canine neoplastic, infectious (including canine distemper), allergic and autoimmune diseases, which share similarities with human disorders and thus have significance for translational medicine, have been discussed. The impact of CDV upon professional antigen presenting cells was investigated in the third part of the thesis. Similar to human measles virus, CDV is supposed to inhibit terminal differentiation of DCs, responsible for disturbed repopulation of lymphoid tissues and diminished antigen presenting function in dogs. In order to testify the hypothesis that CDV-infection leads to an impairment of co-stimulatory functions of professional antigen presenting cells, canine DCs have been generated from peripheral blood monocytes in vitro and infected with CDV. Virus infection was confirmed and quantified by transmission electron microscopy, CDV-specific immunofluorescence and virus titration. Phenotypical changes of cultured cells were determined by flow cytometry. In addition, apoptotic changes and cellular damage were quantified by the terminal desoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling-method and lactate dehydrogenase-assay, while cell proliferation was determined by 5-bromo-2’-deoxyuridine-incorporation. Results demonstrated a significant time dependant increase of the infectivity rate of DCs at 24, 72 and 120 hours post infection (hpi). As observed by flow cytometry at 120 hpi, CDV-infection of canine DCs led to a down-regulation of co-stimulatory molecules CD80 and CD86 as well as of MHC II, indicating disturbed antigen presenting properties. As a potential mechanism to evade host immune responses, infected DCs showed no evidence of apoptosis or cell lysis at 24, 72 and 120 hpi. Similarly, cell proliferation rate of infected cells was unaffected at any investigated time points. These data suggest that CDV-infection of DCs plays a role for pathogenesis of long lasting immune alterations and virus persistence in canine distemper. In conclusion, results of the present study support the hypothesis that an inadequate immunoregulation as a consequence of Treg depletion promotes the development of early CNS lesion in canine distemper. These findings are in agreement with previous reports, that initiation of inflammation in myelin disorders is influenced by an immunological imbalance of the peripheral immune system. As suggested for human MS, the development of novel therapies targeting Treg represents a promising strategy in canine neurological disorders. Moreover, getting insights into the interaction between viruses and DCs is fundamental to understand the pathogenesis of infectious disorders, which has implication for prevention (e.g. vaccination) and treatment strategies. Since dogs are appreciated as translational animal models for several human diseases observations in canine distemper might have relevance also for human CNS disorders
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