Pharmakologische Charakterisierung der murinen Histamin H1 und H4 Rezeptoren

Saad, Kaula

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Pharmakologische Charakterisierung der murinen Histamin H1 und H4 Rezeptoren

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Das Ziel dieser Dissertation war die Etablierungvon In-vitro und In-vivo-Modellen zur Untersuchung von Histaminrezeptor-Liganden in der Maus. Im ersten Teil sollten die Eigenschaften der Histaminrezeptoren H1R und H3R der Maus in rekombinanten Systemen unter vergleichbaren experimentellen Bedingungen untersucht werden. Auf diese Weise können rezeptorabhängige Unterschiede und molekulare Grundlagen von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen festgestellt werden. Voraussetzung für derartige Untersuchungen an rekombinanten Testmodellen ist die Expression des H1- und des H3-Rezeptorproteins in einer Membran, die durch Verwendung des Sf9-Zell/Baculovirus-Expressionssystems erzeugt wird. Zunächst musste die cDNA des mH1R und mH3R kodiert und in einen Baculovirus-Transfer-Vektor integriert werden. In dem verwendeten System wurde auf den Baculovirus-Transfer-Vektor pVL-1392 zugegriffen. Sf9-Zellen (von Spodoptera frugiperda) werden mit dem pVL-Plasmid und mit unvollständiger linearisierter Baculovirus-DNA co-transfiziert. Die Bindungseigenschaften der mH1R und mH3R wurden in der Radioligandenbindungsstudie mit dem Agonisten [3H] Histamin und den Antagonisten [3H] Meypramin als Radioliganden bestimmt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Bindungsaffinität von [3H] Histamin und [3H] Meypramin am mH1R und mH3R unzureichend war. Die Affinität des mH1R und mH3R zu den Liganden konnte aufgrund der niedrigen Expressionsrate in Sf9-Zellen nicht bestimmt werden. Diese Ergebnisse bestätigen diejenigen, die bereits für den mH4R bekannt sind. Auch für mH4R war die Expressionsrate in Sf9-Zellen so gering, dass Ligandenbindungsstudien nicht möglich waren. Daher wurde ein anderes Transfektionssystem gewählt und Untersuchungen am murinen H1R und H4R durchgeführt, da diese beiden Rezeptoren am Juckreizgeschehen der Maus involviert sind. So erfolgte die Expression und Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften der murinen H1R und H4R unter Verwendung der NIH-3T3-Zellen als eukaryotisches Expressionssytem. NIH-3T3-Zellen wurden mit dem mH1R oder mH4R unter Verwendung der Lipofectamin 2000-Methode transfiziert. Als Voraussetzung für die weiteren Versuche wurde die erfolgreiche Transfektion des mH1R und mH4R in den NIH-3T3-Zellen zunächst mittels Western-Blot bestätigt. Außerdem wurde der Nachweis des mH4R mittels RT-PCR auf der mRNA-Ebene durchgeführt. In vitro wurde der Einfluss der H4R-Agonisten ST1006 und 4-Methylhistamin sowie Histamin und des H1R-Agonisten Pyridylethylamin auf die chemotaktische Aktivität der H1R- und H4R-transfizierten NIH-3T3-Zellen untersucht. Sowohl ST1006 als auch 4-Methylhistamin führten zu einer signifikant gesteigerten Migration von H4R-transfizierten NIH-3T3-Zellen. Die Hemmung der Migration durch JNJ7777120 spricht für eine hauptsächliche Beteiligung des mH4R an der Migration. Der H1R-Agonist Pyridylethylamin führte dagegen zu einer gesteigerten Migration von H1R-transfizierten NIH-3T3-Zellen. In vivo wurde die Wirkung der H4R-Agonisten ST1006 und 4-Methylhistamin auf die Juckreizentstehung bei der Maus geprüft. Diese Ergebnisse haben zunächst gezeigt, dass sowohl die intradermale Injektion von ST1006 (5 nmol/l und 50 nmol/l) und 4-Methylhistamin (5nmol/l und 50 nmol/l) bei Wildtyp-Mäusen dosisabhängigen Juckreiz auslösen, wohingegen der bei H4R-Knockout-Mäusen signifikant geringer ausfiel. Bei den In-vivo-Untersuchungen in den murinen Kontaktallergiemodellen war von besonderem Interesse, ob der H4R-Agonist ST1006 einen Einfluss auf die Juckreizentstehung hat. Darüber hinaus wurde ein Vergleich mit 4-Methylhistamin angestellt. In murinen Modellen der allergischen Kontaktdermatitis, ausgelöst durch das Hapten Toluylendiisocyanat, konnte der Allergen-induzierte Juckreiz durch intradermale Gabe von ST1006 signifikant gesteigert werden. Sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass der H4R-Agonist ST1006 ein selektiver Agonist am murinen H4R ist. Abschließend konnten die durchgeführten Untersuchungen bestätigen, dass der H4R bei der Allergen-induzierten Juckreizentstehung eine wesentliche Rolle spielt.

The aim of this thesis was the establishment of In-vitro and In-vivo models for the examination of histamine receptor ligands in mice. In the first part, the properties of histamine receptors H1R and H3R of mice in recombinant systems under similar experimental conditions were examined. This enables the investigation of receptor-dependent differences and the molecular foundation of ligand-receptor interactions. A prerequisite for such a study on recombinant test models is the expression of the H1 and H3 receptor proteins in a membrane, which is produced using the Sf9-cell/baculovirus-expression system. To start with the cDNA of mH1R and mH3R had to be coded and incorporated into a baculovirus transfer vector. In the utilised system the baculovirus transfer vector pVL1392 was accessed. Sf9 cells (from Spodoptera frugiperda) were co-transfected with the pVL-plasmid and with incompletely linearised baculovirus DNA. The binding properties of mH1R and mH3R were determined in the radioligand-binding study with the agonist [3H] histamine and the antagonist [3H] meypramin as radioligands. The results have shown that the binding affinity of [3H] histamine and [3H] meypramin was inadequate at recombinant mH1R and mH3R. The affinity of the ligand to mH1R and mH3R could not be determined because of the low rate of expression in Sf9 cells. These results confirm findings that are already known for the mH4R. For mH4R the expression rate in Sf9 cells was so low that ligand binding studies were not possible. Therefore another transfection system was selected and studies on murine H1R and H4R were conducted because these two receptors are involved in processes leading to itching in mice, which allowed translation of in vitro findings to an in vivo setting in mice. As a result the extraction and analysis of the pharmacological properties of the murine H1R and H4R using NIH-3T3-cells as a eukaryotic expression system was conducted. NIH-3T3-cells were transfected with mH1R or mH4R using the Lipofectamine 2000 method. As a prerequisite for subsequent experiments, the successful transfection of mH1R and mH4R in the NIH-3T3-cells was confirmed by Western-blot. In addition, the detection of the mH4R by RT-PCR was carried out at the mRNA level. In vitro the effect of the putative mH4R agonists ST1006 and 4-methylhistamine, as well as histamine and H1R agonists pyridylethylamin on the chemotactic activity of the H1R and H4R-transfected NIH-3T3-cells was examined. Both ST1006 and 4-methylhistamin led to a significant increase in migration of H4R-transfected NIH-3T3-cell. The inhibition of migration by JNJ7777120 suggests a major involvement of the mH4R in the migration. The H1R agonist pyridylethylamin however led to an increased migration of H1R-transfected NIH- 3T3-cells. In the in vivo trials the effect of the H4R agonists ST1006 and 4-methylhistamine on the formation of contact dermatitis in mice was examined. These results have initially shown that both the intradermal injection of ST1006 (5 nmol/site and 50 nmol/site ) and 4-methylhistamine (5 nmol/site and 50 nmol/site ) triggered dose-related itching in wild-type mice, which was significantly lower in the H4R knockout mice. In the i n vivo studies of murine models of contact allergy it was of particular interest whether the H4R agonist ST1006 has an influence on the emergence of itching. Moreover, a comparison with 4-methylhistamine was made. In murine models of allergic contact dermatitis caused by the hapten toluendiisocyanate, the allergen-induced itch could be significantly increased by intradermal administration of ST1006. Both the in vitro and in vivo results of this study indicate that the human H4R agonist ST1006 is also a selective agonist on the murine histamine H4R. Finally, the tests carried out confirm that the histamine H4R plays an important role in allergen-induced itch formation.