Epidemiological study on Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in North West Germany

Yersinia ruckeri, der Erreger der Rotmaulseuche (Enteric Redmouth Disease,ERM), ist eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten in der Regenbogenforellenzucht in Europa. Obwohl im allgemeinen Y. ruckeri gut durch Impfungen und Antibiotikabehandlungen kontrolliert werden konnte, waren Ausbrüche dieser Krankheit noch regelmäßig zu beobachten, vor allem in endemischen Gebieten. Darüber hinaus scheinen einige Y. ruckeri Stämme nicht auf bestimmte kommerzielle Impfstoffe zu reagieren. Alle diese Stämme waren unbeweglich, während in früheren Ausbrüchen isolierte Stämme von beweglich waren. Es wurde vermutet, dass die Impfung einen selektiven Druck auf die Bakterien ausübt, der das Entstehen von nicht beweglichen Stämmen ermöglichte, die gegen die kommerziellen Vakzine unempfindlich sind. Daher besteht ein hohes Risiko, dass sich diese nicht beweglichen Vakzine-resistenten Stämme ausbreiten und schwere Krankheitsausbrüche in Forellenfarmen verursachen können. Das Ziel dieses Projektes war, genotypische und phenotypische Unterschiede von Y. ruckeri Isolaten aus Nord-West Deutschland zu erfassen und zu analysiere. Es wurden unterschiedliches Koloniewachstum ermittelt, Intraspezies-Vergleiche in Hinblick auf in vitro Toxizität gegenüber verschiedenen Fischzelllinien, der Expression von Pathogenitätsfaktoren insbesondere zwischen beweglichen und unbeweglichen Isolaten angestellt und die Anfälligkeit von Isolaten gegenüber verschiedenen antimikrobiellen Substanzen sowie die genetischen Faktoren einer antimikrobiellen Resistenz untersucht. Ziel war es die Situation zu verstehen, mit der die Forellenzucht in Nord-West Deutschland jetzt konfrontiert ist. Seit 2011 wurden 48 Y ruckeri Isolate von 12 Forellenteichwirtschaften in Nordrhein-Westfalen während verschiedener Jahreszeiten gesammelt. Zusätzliche 33 Isolate wurden vom LAVES Hannover und dem Fischgesundheitsdienst Hessen aus klinischen Ausbrüchen von ERM in Niedersachsen und Hessen zur Verfügung gestellt. Ein Referenzstamm wurde von der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover und ein typischer nicht beweglicher Stamm wurde von Dr. Gould vom MSD Animal Health bereitgestellt. Alle Isolate wurden durch biochemische Tests, Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) und Repetitive Sequenz-basierte PCR Analysen, inklusive (GTG)5-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR und REP-PCR, charakterisiert. Die Fettsäuremuster der Isolate wurden mittels Gaschromatographie analysiert. Die Cytotoxicität wurde an „Common carp brain“ (CCB), „Epithelioma papulosum cyprini (EPC), „fathead minnow“ Epithelzellen (FHM) und „Rainbow trout gonad-2“ (RTG-2) Zellinien bei verschiedenen Inkubationszeiten und Temperaturen untersucht. Eine Multiplex PCR wurde etabliert, um 10 verschiedene Virulenzfaktor-Gene (Hämolysingene yhlAB, Ruckerbactingene rucC and rupG, Gene des ABC Proteinexportersystems yrp1 and yrpDEF, Flagellare Secretionschaperon- Gene flgA, Gene des Flagellaren Sekretionsapparates flhA) von Y. ruckeri zu detektieren. Die Expression dieser Gene wurde mit einer semi-quantitativen PCR analysiert und verglichen. Empfindlichkeitstests gegenüber antimikrobiellen Substanzen und genetischen Eigenschaften für eine Resistenz gegenüber diesen Substanzen wurde mittels eines Mikrodillutionstest und einer PCR untersucht. Aus den Isolaten konnten acht verschiedenen API 20E Profile erstellt werden, die sich vom Y. ruckeri Referenzstamm DSM 18506 unterschieden. Fünf Isolate wurden mittels 16s rDNA-Sequenzierung als Y. ruckeri bestätigt. 17 Isolate konnten Tween 80/20 hydrolisieren. Alle Y. ruckeri Isolate zeigten 15 wesentliche Fettsäuren, darunter 12:0, 13:0, 13.957 (Gleiche Kettenlänge, ECL unbekannt), 14:0, 14.502 (ECL unbekannt) 15:0 16:1ω5c, 16:0, 17:1ω8c, 17:0 CYCLO, 17:0, 16:1 2OH, 18:1ω9c, 18:1ω7c und 18:0. Zusätzlich zu 17 verschiedenen Mustern der PFGE wurden 2 verschiedene REP-PCR, 5 verschiedene ERIC-PCR, vier (GTG)5 –PCR und drei Muster in der BOX-PCR Analyse entdeckt. Entsprechend der Resultate aus API 20, PFGE und den verschiedenen PCR Analysen konnten die Isolate in 27 verschiedene Gruppen unterteilt werden. In den Regenbogenforellen der meisten untersuchten Fischfarmen wurden Isolate aus mehr als zwei verschiedenen Typisierungs Gruppen isoliert. Es stellte sich heraus, dass zwei der Isolat-Gruppen in allen drei Bundesländern Nord-West Deutschlands nachgewiesen werden konnten. Nicht bewegliche Stämme haben auf Fischzelllinien in den ersten 24 Stunden eine höhere in vitro Zytotoxizität als bewegliche Stämme, aber nach längerer Inkubationszeit bei niedrigen Temperaturen gibt es keine signifikanten Unterschiede mehr. Alle untersuchten Virulenz-Gene wurden sowohl in den beweglichen sowie auch in den beweglichen Y. ruckeri Stämmen gefunden. Weiterhin konnten in der Expression dieser Gene keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen werden. Für die meisten Antibiotika konnte eine unimodale Verteilung der MHK beobachtet werden. Im Allgemeinen stiegen die MHK mit der Inkubationszeit an. Für Enrofloxacin und Nalidixinsäure wurde eine bimodale Verteilung der MHK Werte festgestellt. Die eine Population zeigte MHK Werte von 0,008-0,015 mg/l bei Enrofloxacin und 0,25-0,5 mg/l bei Nalidixinsäure, während die andere Subpopulation MHK Werte von0,06-0,25 mg/l für Enrofloxacin und 8-64 mg/l für Nalidixinsäure zeigte. Während Isolate (n=3) aus der Subpopulation mit der niedrigeren MHK für (Fluor)chinolon eine nicht mutierte gyrA Wildtyp QRDR Gensequenz besaßen, zeigten (n=10) Isolate der Subpopulation mit der höheren MHK für (Fluor)chinolon eine Punktmutation eines Basenpaares in der gyrA Gensequenz. Dies resultiert in einer Änderung einer Aminosäure im GyrA Protein: Ser zu Arg oder Ser zu Ile (an Position 83) oder Asn zu Tyr (an Position 87) (Escherichia coli Nummerierung). Ein einzelnes Isolat zeigte hohe MHK für Sulfamethoxazol und Sulfamthoxazol/Trimethoprim. Ein etwa 8.9kb großes Plasmid wurde in diesem Isolat gefunden, dass die Gene sul2 strB und eine dfrA14 Genkasette die in das strA Gen integriert war aufwies. Weder Klasse 1 noch Klasse 2 Integrine konnten in diesen Isolaten gefunden werden. Schlussfolgernd hieraus kann gesagt werden, das es eine Vielzahl von Y. ruckeri Stämmen in Nordwest Deutschland gibt, die zu einem Großteil aus nicht motilen Stämmen bestehen. In den meisten Farmen aus der Feldstudie waren zwei oder mehr verschiedene Y. ruckeri Isolate vorhanden. Im Winter war es einfacher für nicht bewegliche Stämme Krankheitsausbrüche hervorzurufen, da sie bei niedrigeren Temperaturen aktiver als die beweglichen Stämme waren. Die Fettsäure Zusammensetzung von Y. ruckeri Isolaten war homogen und es gab keine offensichtliche Verbindung zwischen den Fettsäuremustern und den epidemiologischen Parametern. Bewegliche Stämme von Y. ruckeri konnten in dieser Studie von nicht beweglichen Stämmen weder durch die Präsenz von Virulenzantigenen noch durch die Expression dieser Gene unterschieden werden. Die Inkubation von 24-28 Stunden bei 22+/-2°C scheint ausreichend zu sein, um die Empfindlichkeit von Y. ruckeri gegenüber antimikrobiellen Substanzen zu testen. Die große unimodale MHK Verteilung lässt vermuten, dass die meisten getesteten Isolate den Wildtyp repräsentieren, der keine Resistenzmechanismen erworben hat. Erwartungen waren (i) das Auffinden von Isolaten mit erhöhten MHK für (Fluor)chinolone die außerdem eine Resistenz vermittelnde Mutation in der QRDR Region des gyrA Gens, und (ii) Isolate, die Plasmidvermittelte sul2, dfrA14, ΔstrA und strB Gene tragen. Diese Untersuchungen bestätigten, dass Y. ruckeri fähig ist, Mutationen für eine Fluor)chinolon Resistenz zu entwickeln, aber ebenso Plasmid vermittelte Resistenzen zu erwerben.