Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

A comparative investigation on the pathogenesis of axonal injury and the involvement of axonal transport mechanisms in viral and traumatic canine central nervous system diseases

Lempp, Charlotte Philippine

Axonal injury is a pivotal element of demyelinating, inflammatory and traumatic central nervous system (CNS) injury. Besides its relevance in veterinary medicine, canine distemper virus (CDV) encephalitis and spinal cord injury (SCI) caused by intervertebral disk disease (IVDD) in dogs are regarded as suitable, naturally occurring animal models that share similarities with Multiple Sclerosis and human SCI, respectively. With respect to the pathogenesis of axonal injury in these canine diseases, recent studies have highlighted a crucial involvement of axonal alterations affecting the axonal cytoskeleton and transport mechanisms, respectively. The clinical relevance of the temporal development of axonal injury in both diseases is undisputable, however, the detailed underlying mechanisms of injury still remain enigmatic so far. Functionally successful regenerative mechanisms, which are evident in peripheral nerve injury, do not succeed in the central nervous system due to the inability of factors promoting axonal outgrowth to achieve effective regeneration which provides an inhibitory environment. However, numerous promising attempts have been made in other CNS disease models in order to enhance the efficacy of endogenous promotional factors or to suppress inhibitory factors, consequently providing a favourable microenvironment for axonal outgrowth. The present study aimed at a detailed and comparative analysis of axonal alterations in CDV encephalitis and IVDD in order to gain sophisticated insights into the pathogenesis of axonopathy in these canine diseases that might in part be extrapolated to the human disease counterparts. Formalin fixed-and paraffin-embedded tissue from the cerebellum of naturally CDV-infected dogs and from the spinal cord of dogs suffering from IVDD has been investigated morphologically on hematoxylin-eosin stained sections to characterize and classify lesions. A total of 120 lesions in the cerebellum of 17 dogs with CDV was classified into 7 groups with different disease stages and were compared to 8 healthy controls. Dogs with IVDD were grouped into 9 dogs with acute, 8 dogs with subacute lesions, and 10 neurologically healthy animals which served as controls. Cytoskeletal proteins comprising phosphorylated and non-phosphorylated neurofilament (pNF and nNF), axonally transported amyloid precursor protein (APP) have been investigated quantitatively using immunohistochemistry in dogs with CDV encephalitis. The microtubules alpha-acetylated tubulin and ß-tubulin III, and the axonal motorproteins kinesin, dynein and the microtubule-associated protein tau-1 have been evaluated quantitatively by means of immunohistochemistry in both dogs with CDV encephalitis and dogs with SCI. Furthermore, myelin basic protein (MBP) expression has been investigated quantitatively in dogs with CDV. In addition, quantitative analysis of the expression of molecules inhibiting axonal outgrowth, including neurite outgrowth inhibitor A (Nogo-A) and leucine rich repeat and lg domain containing 1 (LINGO-1) as well as of factors promoting axonal outgrowth comprising erythropoietin (EPO), its receptor (EPO-R), and hypoxia-inducible factor (HIF)-1α has been performed using immunohistochemistry. Moreover, expression of growth-associated protein (GAP)-43 was quantitatively evaluated in dogs with CDV in order to detect axonal outgrowth. Statistical anaylsis was performed using Kruskal-Wallis Test with subsequent pair-wise comparisons using Mann-Whitney-U Test. P values below 0.05 were considered significant. In CDV encephalitis, a progressively decreased expression of cytoskeletal constituents (pNF, alpha-acetylated tubulin and ß-tubulin III) as well as of motorproteins (kinesin, dynein and tau-1) was detected beginning already in the early phase of the disease, accompanied by a parallel accumulation of axonally transported APP as well as nNF. In the spinal cord, in contrast, microtubules were evident in the injured and swollen axons, but without significant differences compared to the controls. Previous results demonstrated a significantly increased expression of neurofilaments and APP in dogs with SCI. While kinesin and tau-1 displayed significantly higher expression in both the acute and subacute stages compared to controls, dynein was significantly increased only in the late phase of disease in dogs with SCI. Expression of both inhibitory as well as promotional factors affecting axonal outgrowth remained on low levels in CDV encephalitis. Nogo-A was increased beginning from the early phase of the disease, whereas LINGO-1 did not show any significant changes in the entire time course. GAP-43 as well as EPO and HIF-1α exhibited a delayed increase in the advanced phase of disease, while EPO-R showed progressively reduced axonal expression beginning at the acute phase. In the spinal cord of dogs with SCI, in contrast, there was an increasing expression of LINGO-1 of both acute and subacute groups compared to controls, but not of Nogo-A. All of the investigated molecules promoting axonal outgrowth displayed increased levels in both the early and late phase of the disease. The results of the present study indicate substantial differences in the pathogenesis of axonal injury between the virus-induced demyelinating disease and the traumatic damage. There is evidence of early arising disturbances of the axonal cytoskeleton resulting in a defective axonal transport and finally leading to a total and presumably irreversible loss of axons in CDV encephalitis, axonal injury in SCI appears to primarily affect axonal transport systems with potentially reversible accumulation of both deleterious and promoting factors. This additionally implicates that axonal transport and the axonal cytoskeleton are rather preserved in proximal and distal segments. While the investigated inhibitory factors do not seem to play substantial role in the pathogenesis of axonopathy in CDV, axonally expressed LINGO-1 may be involved in axonal outgrowth inhibition in SCI and could represent a promising therapeutic target. Although there is evidence of regenerative attempts in CDV as demonstrated by detection of GAP-43-immunopositive axons, regeneration does not arise before the late phase of the disease and is preceded by substantial axonal injury, which presumably inhibits axonal regeneration in CDV encephalitis. In SCI, up-regulation of promotional factors arises simultaneously to disturbances in the axonal cytoskeleton and transport systems, implicating a promising role in favouring regeneration.

Axonale Schäden sind wesentlich an demyelinisierenden, entzündlichen und traumatisch bedingten Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin haben die durch das kanine Staupevirus (canine distemper virus, CDV) ausgelöste Staupeenzephalitis und die in Folge von Bandscheibenvorfällen entstehenden Rückenmarksschädigungen (spinal cord injury, SCI) des Hundes einen hohen Stellenwert als spontan auftretende Modellerkrankungen für die Multiple Sklerose (MS) und traumatische Rückenmarksverletzungen beim Menschen erlangt. Untersuchungen über die Pathogenese von Axonschädigungen ergaben Hinweise auf eine wesentliche Beteiligung des axonalen Zytoskeletts und axonaler Transportmechanismen an deren Entstehung. Während die klinische Bedeutung des entstehenden Axonschadens bei den genannten Erkrankungen unstrittig ist, bedarf das Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen weiterer Aufklärung. Während regenerative Mechanismen nach Axonschäden im peripheren Nervensystem häufig zu einer funktionellen Wiederherstellung führen, sind Axone des ZNS auf Grund einer inhibitorischen wirkenden Umgebung und der mangelhaften Wirkung promotorischer Moleküle, nicht zu einer effektiven Regeneration in der Lage. Dennoch zeigten zahlreiche Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen, dass axonale Regeneration durch endogen applizierte promotorische oder die Suppression inhibitorischer Moleküle verbessert werden konnte. In dieser Studie sollten die axonalen Schäden bei der Staupeenzephalitis und bei Rückenmarksschäden vergleichend untersucht werden um weitere Einblicke in die Pathogenese bei diesen Tiermodellen zu gewinnen und diese möglicherweise auf die Situation bei humanen Erkrankungen übertragen zu können. Formalinfixiertes und Paraffin-eingebettetes Gewebe aus dem Kleinhirn natürlich staupeinfizierter Hunde und aus dem Rückenmark von Hunden mit Bandscheibenvorfällen wurde morphologisch in einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung untersucht und die Läsionen klassifiziert. Dabei wurden insgesamt 120 Herde im Kleinhirn von 17 Hunden mit einer Staupeenzephalitis in 7 Gruppen verschiedener Erkrankungsstadien und eine Kontrollgruppe (n=8) untersucht.  Bei den Hunden mit Rückenmarksverletzungen wurden eine Gruppe mit akutem Trauma (n=9), eine Gruppe mit subakuten Läsionen (n=9) und eine Kontrollgruppe (n=10) unterschieden. Im Folgenden wurden zytoskelettale Proteine (phosphoryliertes (pNF) und nicht-phosphoryliertes (nNF) Neurofilament) und das axonal transportierte Amyloidvorläuferprotein (amyloid precursor protein, APP) bei Hunden mit einer Staupeenzephalitis immunhistologisch untersucht. Des Weiteren wurde mittels Immunhistologie die Expression von Mikrotubuli (alpha-azetyliertes Tubulin und ß-Tubulin III), Motorproteinen (Kinesin und Dynein) und Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau-1 wurde bei Tieren mit Staupeenzephalitis bzw. mit Rückenmarksverletzungen untersucht. Darüber hinaus wurde die Expression des Myelin-basischen Proteins (MBP) in den Staupeläsionen immunhistologisch detektiert und, ebenso wie die zuvor genannten, quantitativ ermittelt. Die gleichen Methoden wurden zur Ermittlung der Expression inhibitorisch wirkender Moleküle (neurite outgrowth inhibitor A, Nogo-A und leucine rich repeat and lg domain containing 1, LINGO-1) angewandt. Gleiches galt für die promotorisch wirkenden Moleküle Erythropoietin (EPO), dessen Rezeptor (EPO-R) und den Hxpoxie-induzierten Faktor (HIF)-1α. Darüber hinaus wurde bei Hunden mit einer Staupeenzephalitis die Expression von Wachstum-assoziiertem Protein (growth-associated protein, GAP)-43 quantitativ ermittelt. Die Ergebnisse wurden mittels Kruskal-Wallis Test und nachfolgendem paarweisen Gruppenvergleich unter Verwendung des Mann-Whitney-U Tests statistisch untersucht. Dabei wurden p-Werte von unter 0,05 als statistisch signifikant bewertet. In den untersuchten Staupeläsionen war ein progressiver Rückgang der Expression zytoskelettaler Bestandteile (pNF, alpha-azetyliertes Tubulin und ß-Tubulin III), ebenso wie der Transportproteine (Kinesin, Dynein und Tau-1) ab der frühen Phase der Erkrankung detektierbar. Dieser Rückgang wurde begleitet von einem signifikant vermehren Nachweis axonal transportierten APP und nNF. In den Rückenmarksläsionen waren die Mikrotubuli in Sphäroiden und geschwollenen Axonen nachweisbar, hier ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Frühere Studien ergaben in Rückenmarksläsionen eine signifikant erhöhte Expression von Neurofilamenten und APP im Vergleich zur Kontrolle. Während Kinesin und Tau-1 im akuten und subakuten Erkrankungsstadium signifikant erhöht waren, zeigte Dynein nur in der späten Phase eine signifikant erhöhte Expression. Sowohl die inhibitorisch wie auch die promotorisch wirkenden Faktoren wurden im Kleinhirn nur in geringen Mengen exprimiert. Nogo-A zeigte einen Anstieg der Expression ab der frühen Phase der Staupeenzephalitis, während bei LINGO-1 keine signifikanten Veränderungen über die Dauer der Erkrankung detektierbar waren. GAP-43, EPO und HIF-1α zeigten eine verzögert einsetzende erhöhte Expression in subakuten und chronischen Staupeläsionen. Axonal exprimiertes EPO-R wurde hingegen im Krankheitsverlauf in der akuten Phase einsetzend und progressiv vermindert exprimiert. Bei Hunden mit einer Rückenmarksverletzung konnte eine signifikant höhere Expression von LINGO-1 in akuten und subakuten Fällen im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden, während sich für Nogo-A keine signifikanten Veränderungen darstellten. Sämtliche promotorisch wirkenden Moleküle waren im Rückenmark in beiden Phasen der Erkrankung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf wesentliche Unterschiede in der Pathogenese axonaler Schäden zwischen der Virus-induzierten, demyelinisierenden Erkrankung und der traumatischen Schädigung des Gewebes hin. Während es bei der Staupeenzephalitis zu einer früh einsetzenden Schädigung des axonalen Zytoskeletts mit Beeinträchtigung des axonalen Transportes kommt, der final in einem vollständigen und wahrscheinlich irreversiblen Verlust des Axons resultiert, erscheint die Axonschädigung bei traumatischen Rückenmarksläsionen als ein fokaler, mit Desorganisation axonaler Transportmechanismen einhergehender, möglicherweise reversibler Insult mit Akkumulation sowohl schädlicher als auch förderlicher Moleküle. Zusätzlich implizieren diese Ergebnisse einen weitgehenden Erhalt des Zytoskeletts und der Transportmechanismen proximaler und distaler Axonsegmente bei traumatischen Rückenmarksläsionen. Während die untersuchten inhibitorischen Faktoren keine wesentliche Rolle in der Pathogenese axonaler Schäden bei der Staupeenzephalitis zu spielen scheinen, kann der vermehrte Nachweis von LINGO-1 im geschädigten Rückenmark ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt mit dem Ziel der Verhinderung seiner inhibitorischen Wirkung sein. Obwohl der vereinzelte Nachweis Gap-43-positiver Axone in Staupeläsionen als Hinweis auf regenerierende Axone gewertet werden kann, scheint die Tatsache, dass promotorisch wirkende Moleküle erst in der späten Erkrankungsphase und nach dem weitgehenden Verlust intakter axonaler Strukturen aufreguliert werden, zu einem Scheitern regenerativer Versuche zu führen. Bei traumatischen Rückenmarksverletzungen hingegen, kann die bereits früh in der Erkrankung erhöhte Expression regenerationsfördernder Moleküle, die zeitgleich mit dem Auftreten zytoskelettaler Schäden einsetzt, einen erfolgversprechenden Ansatz für axonale Regeneration darstellen.  




Lempp, Charlotte Philippine: A comparative investigation on the pathogenesis of axonal injury and the involvement of axonal transport mechanisms in viral and traumatic canine central nervous system diseases. Hannover 2013. Tierärztliche Hochschule.


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