A comparative investigation on the pathogenesis of axonal injury and the involvement of axonal transport mechanisms in viral and traumatic canine central nervous system diseases

Axonale Schäden sind wesentlich an demyelinisierenden, entzündlichen und traumatisch bedingten Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin haben die durch das kanine Staupevirus (canine distemper virus, CDV) ausgelöste Staupeenzephalitis und die in Folge von Bandscheibenvorfällen entstehenden Rückenmarksschädigungen (spinal cord injury, SCI) des Hundes einen hohen Stellenwert als spontan auftretende Modellerkrankungen für die Multiple Sklerose (MS) und traumatische Rückenmarksverletzungen beim Menschen erlangt. Untersuchungen über die Pathogenese von Axonschädigungen ergaben Hinweise auf eine wesentliche Beteiligung des axonalen Zytoskeletts und axonaler Transportmechanismen an deren Entstehung. Während die klinische Bedeutung des entstehenden Axonschadens bei den genannten Erkrankungen unstrittig ist, bedarf das Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen weiterer Aufklärung. Während regenerative Mechanismen nach Axonschäden im peripheren Nervensystem häufig zu einer funktionellen Wiederherstellung führen, sind Axone des ZNS auf Grund einer inhibitorischen wirkenden Umgebung und der mangelhaften Wirkung promotorischer Moleküle, nicht zu einer effektiven Regeneration in der Lage. Dennoch zeigten zahlreiche Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen, dass axonale Regeneration durch endogen applizierte promotorische oder die Suppression inhibitorischer Moleküle verbessert werden konnte. In dieser Studie sollten die axonalen Schäden bei der Staupeenzephalitis und bei Rückenmarksschäden vergleichend untersucht werden um weitere Einblicke in die Pathogenese bei diesen Tiermodellen zu gewinnen und diese möglicherweise auf die Situation bei humanen Erkrankungen übertragen zu können. Formalinfixiertes und Paraffin-eingebettetes Gewebe aus dem Kleinhirn natürlich staupeinfizierter Hunde und aus dem Rückenmark von Hunden mit Bandscheibenvorfällen wurde morphologisch in einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung untersucht und die Läsionen klassifiziert. Dabei wurden insgesamt 120 Herde im Kleinhirn von 17 Hunden mit einer Staupeenzephalitis in 7 Gruppen verschiedener Erkrankungsstadien und eine Kontrollgruppe (n=8) untersucht.  Bei den Hunden mit Rückenmarksverletzungen wurden eine Gruppe mit akutem Trauma (n=9), eine Gruppe mit subakuten Läsionen (n=9) und eine Kontrollgruppe (n=10) unterschieden. Im Folgenden wurden zytoskelettale Proteine (phosphoryliertes (pNF) und nicht-phosphoryliertes (nNF) Neurofilament) und das axonal transportierte Amyloidvorläuferprotein (amyloid precursor protein, APP) bei Hunden mit einer Staupeenzephalitis immunhistologisch untersucht. Des Weiteren wurde mittels Immunhistologie die Expression von Mikrotubuli (alpha-azetyliertes Tubulin und ß-Tubulin III), Motorproteinen (Kinesin und Dynein) und Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau-1 wurde bei Tieren mit Staupeenzephalitis bzw. mit Rückenmarksverletzungen untersucht. Darüber hinaus wurde die Expression des Myelin-basischen Proteins (MBP) in den Staupeläsionen immunhistologisch detektiert und, ebenso wie die zuvor genannten, quantitativ ermittelt. Die gleichen Methoden wurden zur Ermittlung der Expression inhibitorisch wirkender Moleküle (neurite outgrowth inhibitor A, Nogo-A und leucine rich repeat and lg domain containing 1, LINGO-1) angewandt. Gleiches galt für die promotorisch wirkenden Moleküle Erythropoietin (EPO), dessen Rezeptor (EPO-R) und den Hxpoxie-induzierten Faktor (HIF)-1α. Darüber hinaus wurde bei Hunden mit einer Staupeenzephalitis die Expression von Wachstum-assoziiertem Protein (growth-associated protein, GAP)-43 quantitativ ermittelt. Die Ergebnisse wurden mittels Kruskal-Wallis Test und nachfolgendem paarweisen Gruppenvergleich unter Verwendung des Mann-Whitney-U Tests statistisch untersucht. Dabei wurden p-Werte von unter 0,05 als statistisch signifikant bewertet. In den untersuchten Staupeläsionen war ein progressiver Rückgang der Expression zytoskelettaler Bestandteile (pNF, alpha-azetyliertes Tubulin und ß-Tubulin III), ebenso wie der Transportproteine (Kinesin, Dynein und Tau-1) ab der frühen Phase der Erkrankung detektierbar. Dieser Rückgang wurde begleitet von einem signifikant vermehren Nachweis axonal transportierten APP und nNF. In den Rückenmarksläsionen waren die Mikrotubuli in Sphäroiden und geschwollenen Axonen nachweisbar, hier ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Frühere Studien ergaben in Rückenmarksläsionen eine signifikant erhöhte Expression von Neurofilamenten und APP im Vergleich zur Kontrolle. Während Kinesin und Tau-1 im akuten und subakuten Erkrankungsstadium signifikant erhöht waren, zeigte Dynein nur in der späten Phase eine signifikant erhöhte Expression. Sowohl die inhibitorisch wie auch die promotorisch wirkenden Faktoren wurden im Kleinhirn nur in geringen Mengen exprimiert. Nogo-A zeigte einen Anstieg der Expression ab der frühen Phase der Staupeenzephalitis, während bei LINGO-1 keine signifikanten Veränderungen über die Dauer der Erkrankung detektierbar waren. GAP-43, EPO und HIF-1α zeigten eine verzögert einsetzende erhöhte Expression in subakuten und chronischen Staupeläsionen. Axonal exprimiertes EPO-R wurde hingegen im Krankheitsverlauf in der akuten Phase einsetzend und progressiv vermindert exprimiert. Bei Hunden mit einer Rückenmarksverletzung konnte eine signifikant höhere Expression von LINGO-1 in akuten und subakuten Fällen im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden, während sich für Nogo-A keine signifikanten Veränderungen darstellten. Sämtliche promotorisch wirkenden Moleküle waren im Rückenmark in beiden Phasen der Erkrankung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf wesentliche Unterschiede in der Pathogenese axonaler Schäden zwischen der Virus-induzierten, demyelinisierenden Erkrankung und der traumatischen Schädigung des Gewebes hin. Während es bei der Staupeenzephalitis zu einer früh einsetzenden Schädigung des axonalen Zytoskeletts mit Beeinträchtigung des axonalen Transportes kommt, der final in einem vollständigen und wahrscheinlich irreversiblen Verlust des Axons resultiert, erscheint die Axonschädigung bei traumatischen Rückenmarksläsionen als ein fokaler, mit Desorganisation axonaler Transportmechanismen einhergehender, möglicherweise reversibler Insult mit Akkumulation sowohl schädlicher als auch förderlicher Moleküle. Zusätzlich implizieren diese Ergebnisse einen weitgehenden Erhalt des Zytoskeletts und der Transportmechanismen proximaler und distaler Axonsegmente bei traumatischen Rückenmarksläsionen. Während die untersuchten inhibitorischen Faktoren keine wesentliche Rolle in der Pathogenese axonaler Schäden bei der Staupeenzephalitis zu spielen scheinen, kann der vermehrte Nachweis von LINGO-1 im geschädigten Rückenmark ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt mit dem Ziel der Verhinderung seiner inhibitorischen Wirkung sein. Obwohl der vereinzelte Nachweis Gap-43-positiver Axone in Staupeläsionen als Hinweis auf regenerierende Axone gewertet werden kann, scheint die Tatsache, dass promotorisch wirkende Moleküle erst in der späten Erkrankungsphase und nach dem weitgehenden Verlust intakter axonaler Strukturen aufreguliert werden, zu einem Scheitern regenerativer Versuche zu führen. Bei traumatischen Rückenmarksverletzungen hingegen, kann die bereits früh in der Erkrankung erhöhte Expression regenerationsfördernder Moleküle, die zeitgleich mit dem Auftreten zytoskelettaler Schäden einsetzt, einen erfolgversprechenden Ansatz für axonale Regeneration darstellen.