Morphological and functional integration and survival of intrastriatal dopamine grafts in a rat model of Parkinsons̉ disease

Rumpel, Regina

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Morphological and functional integration and survival of intrastriatal dopamine grafts in a rat model of Parkinsons̉ disease

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Die Pathogenese des Morbus Parkinson ist gekennzeichnet durch Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SN) und Dopamin (DA)-Mangel im Striatum. Durch den fehlenden DA-Input kommt es zur Fehlregulierung im Netzwerk der Basalganglien (BG), z.B. Hyperaktivität im subthalamischen Nukleus (STN). Die intrastriatale Transplantation von dopaminergen Vorläuferzellen aus dem ventralen Mittelhirn (VM) stellt eine Methode dar, um das fehlende DA zu ersetzen und die funktionellen Veränderungen im Gehirn wieder herzustellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich die Transplantate gut in das Empfängerhirn integrieren können. Ebenso führen sie zu langwierigen Verbesserungen der motorischen Symptome. Jedoch waren die Ergebnisse von klinischen Studien bisher sehr unterschiedlich. Bis heute gibt es nur vereinzelte Untersuchungen, die Effekte von Transplantaten auf die neuronalen Veränderungen verschiedener BG-Stationen beschreiben. Ein limitierender Faktor bei der Zellersatztherapie stellt außerdem die geringe Überlebensrate der Transplantate mit begrenzter striataler Innervation dar. Um das Überleben zu steigern, wurden neurotrophe Faktoren (NTF) schon vielfach eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass FGF-2 einen fördernden Einfluss auf das Überleben und Neuritenwachstum von dopaminergen Neuronen hat. Speziell die hochmolekulare (HMW) Isoform zeigte vielversprechende Ergebnisse. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung intrastriataler Transplantate im Rattenmodell des Morbus Parkinson durch extrazelluläre elekrophysiologische Ableitungen im STN und Expressionsanalysen von dopaminergen, GABAergen und glutamatergen Markergenen im STN und Striatum. Zusätzlich wurde der Effekt von FGF-2-HMW auf Überleben und Integration dopaminerger Transplantate, die durch genetische Modifizierung ihren eigenen NTF exprimierten, untersucht. Lädierte Tiere zeigten eine erhöhte Feuerrate im STN, die durch die transplantieren Zellen wieder normalisiert wurde. Im Rotationstest verbesserten sich die transplantierten Tiere signifikant. Weiterhin zeigten unsere Daten eine erhöhte Burst-Aktivität mit irregulär feuernden Neuronen im STN in den lädierten Tieren. Aber allgemein konnte durch die Transplantation ein weniger variables Feuermuster mit mehr regulär feuernden Neuronen erzielt werden. Die Koherenzanalyse im beta-Frequenzband zwischen STN und motorischem Kortex wies eine Erhöhung in den lädierten Tieren auf, welche in transplantierten Tieren wieder auf normale Werte reduziert war. Spezifische Glutamat-Marker zeigten durch die Läsion keine Änderungen, waren aber nach Transplantation im STN und im Striatum anders exprimiert, was auf eine gestörte Glutamat-Homöostase hinweisen könnte. Veränderungen waren ersichtlich in der Expression von DA-Markern der striatalen „medium-spiny“ Neurone (MSNs). Das könnte einen unterschiedlichen Einfluss der Transplantate auf die striatonigralen und striatopallidalen MSNs bedeuten. Die DA-Rezeptorveränderungen, die nach Läsion festgestellt wurden, verteilten sich nach Transplantation um, so dass vermutlich ein Ausgleich zwischen direktem und indirektem Weg stattgefunden hat. Zusätzlich war die erhöhte Aktivität der GABAergen MSNs nach Transplantation wieder normalisiert. In zwei verschiedenen Experimenten wurden Tiere entweder mit nicht-transfizierten, empty-Kontroll- oder FGF-2-HMW-Plasmid transfizierten Zellen transplantiert und analysiert. Verhaltensdefizite verbesserten sich in allen fünf Gruppen (drei große, zwei kleine Transplantatgruppen) mit Ausnahme der Amphetamin-Rotation der FGF-2-HMW small Gruppe. Zusammenfassend hatte die genetische Modifizierung mit dem FGF-2-HMW-Plasmid keine weiteren fördernden Effekte im Vergleich zu Kontrollgruppen, weder auf Verhalten, noch auf das Transplantatüberleben oder die Integration ins Striatum. 13 Wochen nach Transplantation war das überexprimierte FGF-2-HMW Protein (FLAG-Tag) noch im Zellkern nachweisbar, jedoch nur in wenigen Zellen, was an der nicht-viralen Expressionsmethode liegen könnte. Um die Zelltransplantation eine sichere und wirksame Therapie für Morbus Parkinson zu machen, sind vorklinische Studien zur Untersuchung der Effekte auf das Empfängerhirn und weitere Versuche, das Überleben der Transplantate zu steigern mit Fokus auf den optimalen NTF und dessen Dosierung, unabdingbar.

The hallmark of Parkinson’s disease (PD) is the degeneration of dopamine (DA) neurons in the substantia nigra (SN) and resulting DA depletion in the striatum. The striatal axon loss and deficient DA supply lead to dysfunction in the basal ganglia (BG) network, e.g. hyperactivity in the subthalamic nucleus (STN). Intrastriatal transplantation of ventral mesencephalic (VM) DA neurons can restore the deficient DA supply and possibly re-establish the altered physiology. In previous studies, DA grafts have shown to innervate the host brain and promote functional recovery with substantial and long-lasting positive outcome. Still, the results of former clinical trials have been highly variable and heterogeneous. To-date, only a few studies have demonstrated the effects on the neuronal changes in downstream BG targets. In addition, a major limiting factor of cell therapy in PD is the low survival of the grafted DA neurons in combination with restricted striatal innervation. To counteract the problem of poor survival, neurotrophic factors (NTFs) have been widely used in this field. Several studies have demonstrated that FGF-2 mediates survival- and neurite outgrowth-promoting effects on DA neurons. Especially the high molecular weight isoform (HMW) of FGF-2 showed promising results. Aim of the present study was to further characterize intrastriatal rat allografts in the 6-OHDA rat model of PD by electrophysiological extracellular recordings in the STN and gene expression analysis of DA, GABA, and glutamate markers in the STN and striatum. In addition, the effects of FGF-2-HMW on DA grafts simultaneously being the source of their ‘own’ NTF by genetic modification of the grafted VM cells were evaluated to characterize the impact on the grafts with regard to DA neuron survival, striatal fiber integration, and the effects on functional performance. The lesioned animals displayed an increased STN firing rate, which was reduced by intrastriatal grafting of DA neurons. In the rotation test, grafted animals showed substantial improvement. We observed increased burst activity in the STN in DA-depleted animals and overall graft implantation led to a lower variability in the firing behavior or more regularity of firing patterns. The mean coherence of beta synchronization in the STN and motor cortex ECoG was higher in lesioned rats, but reduced in the grafted animals to the level of naive rats. While the lesioned animals showed no alterations of glutamate markers, the grafted animals displayed decreased expression of four genes in the striatum and two genes in the STN indicating a dysregulation of extracellular glutamate homeostasis. Differences could be seen in DA marker gene expression of striatal medium-spiny neurons (MSNs) which might suggest a different impact of DA cell grafts on striatonigral and striatopallidal neuronal subtypes. The DA receptor changes in lesioned rats shifted back to normal levels in grafted rats indicating a rebalancing of the direct and indirect pathway. Additionally, the increased activity of the GABAergic MSNs was normalized in grafted animals. Animals, receiving either non-transfected cells, empty-control-, or FGF-2-HMW-plasmid transfected cells, were analyzed in two different transplantation paradigms. In the five grafted groups (three large graft groups, two small graft groups) behavioral deficits improved, except for amphetamine-induced rotation of the FGF-2-HMW small graft group. Altogether, genetic modification with the FGF-2-HMW plasmid did not further improve functional recovery compared to the control groups. In contrast to the in vitro results of short-term cultures, long-term in vivo application had no effect on either the number of surviving DA neurons or on the density of outgrowing TH-fibers. Albeit, after 13 weeks post grafting overexpressed FLAG-tagged FGF-2-HMW protein was still detectable in the cell nucleus. This was, however, only seen in a few cells, likely due to the transient delivery strategy using a non-viral expression plasmid. These findings underline the importance of preclinical investigations characterizing graft impact on the host and investigating different approaches to increase graft survival. Further studies with regard to the most potent neurotrophic agent and its most effective delivery system and optimum dosage are imperative to ultimately develop an efficacious and safe treatment for PD patients.