Charakterisierung methicillinresistenter Staphylokokken von stationär aufgenommenen Tieren, Personal und Inventar einer Kleintierklinik

Weiß, Sonja

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Charakterisierung methicillinresistenter Staphylokokken von stationär aufgenommenen Tieren, Personal und Inventar einer Kleintierklinik

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Methicillinresistente Staphylokokken (MRS) verfügen über ein zoonotisches Potential und erlangen in der Kleintiermedizin durch gehäufte Beteiligung an nosokomialen Infektionen immer mehr klinische Bedeutung. Trotz zahlreicher Studien fehlen repräsentative Untersuchungen zu Charakterisierung und Bedeutung von MRS bei Kleintieren. Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen der Untersuchung einer Kleintierklinik detaillierte Informationen zu Speziesverteilung, Resistenzverhalten und molekularer Charakteristika von allen detektierten MRS zu erarbeiten. Ein besonderer Fokus wurde auf die Identifizierung multiresistenter Isolate, die Verbreitung dieser Isolate im Klinikumfeld und die Untersuchung mobiler Resistenzgene gelegt. In einer Kleintierklinik wurde eine Beprobung der Klinikräumlichkeiten, des Personals und der stationär aufgenommenen Patienten, vornehmlich Katzen, durchgeführt. Die genommenen Tupferproben wurden über Nacht vorangereichert und nachfolgend auf Mueller-Hinton-Agar mit Oxacillinzusatz inokuliert. Alle Isolate wurden mittels Gramfärbung überprüft. Die Spezies aller oxacillinresistenten, mecA-positiven Staphylokokken wurde mithilfe des biochemischen Reaktionskits ID32 STAPH, der Koagulasetestung, sowie gegebenenfalls durch 16S rDNA-Sequenzanalyse bestimmt. Die Empfindlichkeitstestung wurde mittels Bouillondilutionsverfahren durchgeführt. Auf Basis des Resistenzphänotyps wurden mittels PCR-Assays Resistenzgene detektiert. Durch Plasmidpräparationen, Hybridisierungsexperimente und Plasmidübertragungsversuche wurde die Lokalisation nachgewiesener Resistenzgene untersucht. Ein neuartiges Resistenzplasmid wurde vollständig sequenziert und hinsichtlich seiner genetischen Struktur und Organisation analysiert. Alle Isolate wurden mit für die jeweilige Spezies anwendbaren, etablierten Typisierungsmethoden charakterisiert. Hierbei wurden die SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) Typisierung, die dru (direct repeat unit) Typisierung, die spa (staphylococcal protein A) Typisierung und die Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST) angewandt. Zusätzlich wurde für die weitere Differenzierung von Isolaten mit gleichen oder sehr ähnlichen Charakteristika die SmaI-Makrorestriktionsanalyse durchgeführt. Aus 72 Tupferproben konnten 34 MRS isoliert werden, davon fünf methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) und 29 methicillinresistente koagulasenegative Staphylokokken (MRCoNS). Innerhalb der 29 MRCoNS wurden 21 Staphylococcus epidermidis (MRSE), sechs Staphylococcus haemolyticus und zwei Staphylococcus pettenkoferi identifiziert. Alle Isolate waren multiresistent, da sie gegenüber mindestens drei, maximal zehn verschiedenen Wirkstoffklassen Resistenzen zeigten. Die SCCmec Typisierung ergab die SCCmec Typen IV oder V, vier Isolate blieben nicht typisierbar. Bei der dru Typisierung wurden neben bekannten auch fünf neue dru Typen detektiert (dt5i, dt9bb, dt9bc, dt10cb, dt12w). Vier MRSA-Isolate gehörten dem bei Nutztieren häufigen klonalen Komplex (CC) 398 an, zwei davon wurden bei Katzen detektiert. Das übrige Isolat wurde als Sequenztyp (ST) 217 identifiziert. Die spa Typisierung ergab für die vier MRSA CC398-Isolate charakteristische spa Typen (t011, t034), das übrige MRSA-Isolat zeigte den spa Typ t032. MLST für die MRSE-Isolate ergab ST5 als vorherrschenden ST in 17 Isolaten, jeweils einzelne Isolate wurden als ST2, ST10, ST48 und ST66 identifiziert. Alle MRSE-Isolate bis auf das ST66 Isolat gehörten damit dem bei S. epidermidis vorherrschenden CC2 an. Neben Isolaten, die ähnliche oder unterschiedliche Resistenzeigenschaften und molekulare Charakteristika zeigten, konnte ein multiresistenter MRSE-Klon aus insgesamt neun Proben von der Klinikeinrichtung, zwei stationär aufgenommenen Katzen und einer Angestellten isoliert werden. Die Vertreter dieses MRSE-Klons besaßen ein mit pSWS47 bezeichnetes 28.743 Basenpaare großes Multi-Resistenzplasmid, welches neben fünf intakten [vga(A), tet(L), dfrK, aadD und tet(M)] und einem inaktiven Resistenzgen (ΔblaZ) Teile von Transposons sowie mehrere Insertionssequenzen aufwies. Dabei war der Nachweis des Tetracyclin-Resistenzgens tet(M) von besonderer Bedeutung, da dieses Resistenzgen bei Staphylokokken bisher noch nicht auf Plasmiden identifiziert wurde. In Tierkliniken müssen die Kontamination der Umgebung und die Kolonisation von Tieren mit multiresistenten MRS als Risiko für nosokomiale Infektionen begriffen werden. Besonders weil die größte Zahl von MRS im Stationsbereich isoliert wurde, sollte die Wichtigkeit von Hygiene und geeigneten Desinfektionsmaßnahmen betont sowie die Anwendung von wirksamen Hygiene- und Infektionsschutzprotokollen in der Kleintiermedizin etabliert werden.

Methicillin-resistant staphylococci (MRS) have a zoonotic potential and gain increasing importance in small animal medicine due to their frequent involvement in nosocomial infections. Although numerous studies have been performed, there is still a lack of representative monitoring programs that deal with the characterization and significance of MRS in small animal medicine. The aim of this study was to provide detailed information with regard to species distribution, antimicrobial resistance and molecular characteristics of all detected MRS in a small animal clinic. Particular emphasis was put on the identification of multi-resistant isolates, their dissemination within the clinic and the investigation of mobile resistance genes. Samples were taken from hospitalized pets, employees and the clinic facilities of a small animal clinic and cultured by overnight broth enrichment and subsequent inoculation on Mueller-Hinton agar plates supplemented with oxacillin. All isolates were screened via Gram staining. The species of all oxacillin-resistant, mecA-positive staphylococci was determined using the biochemical reaction kit ID32 STAPH, coagulase testing and 16S rDNA sequence analysis, if necessary. Minimum inhibitory concentrations were determined by broth micro- and macrodilution. Based on phenotypic antimicrobial resistance properties, resistance genes were detected by PCR assays. The genetic location of resistance genes was investigated by plasmid preparations, Southern hybridization experiments and plasmid transfer experiments. A novel multi-resistance plasmid was completely sequenced and analyzed for its structure and organization. All isolates were characterized using molecular typing methods applicable to the respective staphylococcal species. These methods included the SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) typing, the dru (direct repeat unit) typing, the spa (staphylococcal protein A) typing and the multilocus sequence typing (MLST). In order to distinguish between highly clonal and similar isolates, SmaI macrorestriction analysis was additionally performed. Among the 34 MRS isolated from the 72 swabs, five isolates were identified as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and 29 isolates belonged to different species of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci (MRCoNS). The group of MRCoNS consisted of methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE; n=21), methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus (n=6) and methicillin-resistant Staphylococcus pettenkoferi (n=2). All isolates were multi-resistant, as they showed resistance to at least three and at maximum ten different classes of antimicrobial agents. SCCmec typing revealed the presence of SCCmec types IV or V, whereas four isolates remained non-typeable by the methods applied. The dru typing detected five novel dru types (dt5i, dt9bb, dt9bc, dt10cb and dt12w) as well as already known dru types. Four MRSA isolates belonged to the clonal complex (CC) 398, which has often been detected in livestock. In this study, two MRSA CC398 isolates were detected in samples of hospitalized cats. The remaining isolate was identified as sequence type (ST) 217. The four MRSA CC398 isolates showed characteristic spa types (t011, t034), the fifth MRSA isolate showed spa type t032. MLST for MRSE isolates yielded ST5 as the predominant ST in 17 isolates, whereas only single isolates represented ST2, ST10, ST48 and ST66, respectively. All MRSE isolates, except for the ST66 isolate, belonged to CC2, the predominant CC of S. epidermidis. Besides the detection of isolates with similar or different resistance properties and molecular characteristics, a multi-resistant MRSE clone was identified in nine different samples, which originated from hospitalized cats, clinic facilities and an employee. The respective MRSE isolates harbored a 28,743 bp multi-resistance plasmid, designated pSWS47. This plasmid carried five functionally active resistance genes [vga(A), tet(L), dfrK, aadD and tet(M)], an inactive resistance gene (ΔblaZ) parts of transposon-like elements and several truncated or intact insertion sequences. The detection of the tetracycline/minocycline resistance gene tet(M) was of particular relevance as a plasmid location of this gene has not been reported before in staphylococci. The contamination of small animal hospitals and the colonization of pets with MRS bear the risk of increasing involvement of MRS in nosocomial infections in the veterinary field. As most MRS isolates were detected in the stationary area, the importance of hygiene and appropriate disinfection procedures has to be emphasized and efficient hygiene and infection control protocols need to be developed and applied routinely in small animal practice.