Einfluss der In-vitro-Maturationsbedingungen boviner Oozyten auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher In-vitro-Reifungsbedingungen auf die molekulare Qualität boviner Kumuluszellen und Oozyten zu untersuchen. Von November 2010 bis Februar 2011 wurden insgesamt (n=962) Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Schlachthofovarien gewonnen und entweder bei 5% O2 oder bei 20% O2 gereift. Das Steroidhormon Progesteron ist lipophil und aufgrund dieser Eigenschaft wurde zusätzlich der Einfluss einer Ölüberschichtung des Mediums (TCM 199) bei den respektiven Sauerstoffkonzentrationen untersucht. Insgesamt gab es fünf Versuchsgruppen: unreif, 5% Öl; 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei. Im Anschluss an die Maturationsphase wurden die Kumuluszellen manuell entfernt. Um die Kernreifungsrate zu ermitteln, erfolgte die Fixierung und anschließende Färbung von 279 Oozyten aus allen Gruppen. Im Weiteren wurde die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene sowohl in Oozyten (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) als auch in Kumuluszellen (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR, FSHR) mittels RT-qPCR untersucht. Die Ermittlung der relativen Proteinmenge des nuklearen Progesteronrezeptors (nPR) erfolgte mit der Western Blot-Analyse und einem nachfolgenden Chemilumineszenzverfahren. Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:   1. Die durchschnittliche Kernreifungsrate wies keinen signifikanten Unterschied innerhalb der verschiedenen Gruppen auf und lag zwischen 83 und 88 %.   2. Der relative mRNA-Gehalt des PGR war in Oozyten, die bei einer O2-Konzentration von 20% reiften, signifikant höher als in Eizellen, die unter einer geringeren O2-Konzentration (5%) reiften.   3. Wenn die IVM unter einer O2-Konzentration von 5% durchgeführt wurde, war in Kumuluszellen der relative Gehalt von STAR-, CYP19A1-, PTGFR-, LHCGR-, FSHR-mRNA und in Oozyten die relative Menge von GDF9-mRNA signifikant höher als bei einer IVM unter einer hohen (20%) O2-Konzentration.   4. In den Gruppen mit einer Silikonölüberschichtung des Reifungsmediums waren die relativen Transkriptmengen von STAR, CYP19A1 und PTGFR in reifen Kumuluszellen im Gegensatz zu den Gruppen ohne Ölüberschichtung des Maturationsmediums signifikant erhöht. In Oozyten, die in Medium gereift wurden, welches nicht mit Öl überschichtet wurde, war die relative Transkriptmenge von GDF9 und BMP15 signifikant höher als in solchen, bei denen das Maturationsmedium mit Öl überschichtet war.   5. Auf Proteinebene konnte in unreifen und reifen Oozyten sowie in reifen Kumuluszellen die Isoform B des nPRs und in unreifen und reifen Kumuluszellen die Isoformen A und C des nPRs identifiziert werden.   6. In reifen Kumuluszellen war die relative Proteinmenge der Isoformen B und C des nPRs sowie in reifen Oozyten die der Isoform B signifikant erhöht, wenn die IVM unabhängig von der Ölüberschichtung bei einer O2-Konzentration von 20% erfolgte.    7. In reifen Kumuluszellen war beim Einsatz eines ölüberschichteten Reifungsmediums die Proteinexpression der Isoform B des nPRs im Gegensatz zu der Reifung in Maturationsmediums ohne Silikonölüberschichtung signifikant erhöht.   8. Bei der Analyse des Progesterongehaltes im Reifungsmedium zeigte sich eine Interaktion zwischen der Ölüberschichtung und der O2-Konzentration. Je höher die O2-Konzentration während der IVM, desto höher die Progesteronmenge im Reifungsmedium. Die höchste Progesteronmenge je KOK konnte in der Gruppe 20% ölfrei (303,5 ±18,5 ng/KOK) gemessen werden.   In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss der Sauerstoff- und der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium auf die Ausbildung der nPR-Isoformen A, B und C in reifen bovinen Kumuluszellen und Oozyten dargestellt. Der relative mRNA-Gehalt des PGR und die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen B und C war abhängig von der O2-Konzentration während der IVM. Wurde die Reifung der KOK unter einer atmosphärischen O2-Konzentration (20%) durchgeführt, war der relative mRNA-Gehalt des PGR in reifen Oozyten und die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen B und C in reifen Kumuluszellen signifikant höher als in den Vergleichsgruppen. Die Proteinexpression der Isoform B wurde ebenfalls durch die Progesteronkonzentration im Medium beeinflusst. In Kumuluszellen, die im ölüberschichteten Maturationsmedium reiften, war die relative Proteinmenge der Isoform B signifikant höher als in denen aller anderen Versuchsgruppen. Auch die relativen mRNA-Gehalte für Gene, die an der Steroidsynthese beteiligt (STAR, HSD3B1, CYP19A1 und LHCGR) sind, wiesen eine Abhängigkeit von der Ölüberschichtung des Reifungsmediums auf. So waren diese bei einer niedrigeren Progesteronkonzentration im Medium erhöht. Ob sich die Auswirkungen der verschiedenen IVM-Bedingungen (O2- und Progesteronkonzentration) auf die Proteinexpression des nPR auch im Weiteren die Entwicklungskompetenz der Oozyte beeinflusst, könnte durch weitere Untersuchungen, in denen morphologische Kriterien, wie z.B. die Blastozystenrate, und/oder in denen entwicklungsrelevante Gene auf mRNA- und Proteinebene  analysiert werden, erfolgen. Die Analyse von speziellen Transkripten (z.B. Thioredoxin interacting protein) stellt eine Möglichkeit dar, festzustellen, ob unter einer geringen O2-Konzentration während der IVM oxidativer Stress in der Oozyte überhaupt vorliegt.