Analyse der zytoplasmatischen Domäne eines Alphacoronavirus Spike-Proteins und ihrer Funktion beim Zusammenbau von Viruspartikeln

Coronaviren (CoV) sind behüllte Viren mit einem positiv-orientierten RNA-Genom. Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) ist ein Vertreter der Alphacoronaviren. Innerhalb der Hülle von TGEV liegen drei Glykoproteine vor, das Spike (S)-, das Membran (M)- und das Envelope (E)-Protein. Das S-Protein ist verantwortlich für die Bindung an den zellulären Rezeptor und die anschließende Fusion von viraler und zellulärer Membran während des Viruseintritts. Der Einbau des S-Proteins in Viruspartikel erfolgt durch die Interaktion mit dem M-Protein. Innerhalb der zytoplasmatischen Domäne des TGEV S-Proteins befinden sich ein cysteinreiches Motiv (CRM) und ein tyrosinbasiertes Retentionssignal, das für die Retention am Ort des Viruszusammenbaus (Endoplasmatische Retikulum-Golgi-intermediäre Kompartiment, ERGIC) sorgt. CRMs in membrannahen Proteinsequenzen werden oft post-translational palmitoyliert. Studien an anderen Coronaviren konnten bereits zeigen, dass die Palmitoylierung des S-Proteins wichtig sein kann für die CoV-Infektiösität, die Zell-Zell-Fusion, die S-M-Proteininteraktion oder beim Einbau des S-Proteins in Viruspartikel. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des CRM des TGEV S-Proteins während des Zusammenbaus von TGEV-Partikeln und die Rolle des CRM und des tyrosinbasierten Retentionssignals bei der S-M-Proteininteraktion untersucht. Um essentielle Cysteine innerhalb des CRM, zu identifizieren wurden verschiedene Cys-Mutanten kloniert. Mit Hilfe von VLP(Virusähnliche-Partikel)-Assays konnte gezeigt werden, dass eine volle Cys-Mutante nicht in VLPs eingebaut wird, partielle Cys-Mutanten hingegen schon. Die Lage der Cysteine spielte dabei keine Rolle. Durch metabolische Markierung mit 3H-Palmitinsäure konnte gezeigt werden, dass die volle Cys-Mutante palmitoylierungsdefizient ist, die partiellen Mutanten allerdings acyliert werden. Die S-M-Proteininteraktion war bei der palmitoylierungsdefizienten Mutante jedoch nicht beeinträchtigt, wie in Koexpressions-Studien in Immunfluoreszenzanalysen gezeigt werden konnte. Des Weiteren konnte durch Konfokalmikroskopie gezeigt werden, dass Mutationen innerhalb des S-Proteins, die eine Retention des Proteins verhindern, ebenfalls keinen Einfluss auf die Interaktion mit dem M-Protein hatten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Palmitoylierung des S-Proteins wichtig ist für dessen Einbau in Viruspartikel und dass der S-M-Proteininteraktion und dem S-Proteineinbau beim Zusammenbau von TGE-Viruspartikeln unterschiedliche Bedingungen zu Grunde liegen.