Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparative molecular analysis of Staphylococcus aureus from intensive livestock farming with emphasis on LA-MRSA of poultry origin

Since a few years Staphylococcus aureus, especially livestock-associated methicillin-resistant S. aureus (LA-MRSA), has been the focus of many studies, but only limited information on LA-MRSA from poultry origin was available at the beginning of this Ph.D. project. The aims of this study were (i) to comprehensively characterize livestock-associated S. aureus of poultry origin, (ii) to answer the question if MRSA is a food-borne pathogen, (iii) to provide an overview on antimicrobial resistance genes in staphylococci, and (iv) to identify novel antimicrobial resistance genes in LA-MRSA isolates. In the first part of the Ph.D. project, three different test populations were investigated. The first test population included 131 isolates from clinically ill turkeys and chickens (CHAPTER 3). Among the turkey isolates (n=80), the clonal complex (CC) 398 predominated and 21.2 % were LA-MRSA. The majority of chicken isolates (n=51) belonged to CC5 and only 9.8 % were LA-MRSA, however, all were identified as LA-MRSA CC398. In the other two studies 37 LA-MRSA CC398 isolates from four different broiler farms (broilers n=11, broiler houses n=15, farm residences n=5, humans living and/or working on the farms n=6) (CHAPTER 4) and 46 LA-MRSA CC398 and CC9 isolates from broilers at four different slaughterhouses (n=28) and workers at the respective poultry slaughterhouses (n=18) (CHAPTER 6) were investigated in order to explore transmission between different reservoirs. Molecular analysis of all LA-MRSA isolates from the three test populations showed two SCCmec types (IV and V), seven spa types (mainly t011) and twelve dru types (mainly dt11a or dt10q). Susceptibility testing, DNA microarray analysis and/or gene specific PCR assays, respectively, revealed highly variable resistance phenotypes (n=41) and genotypes (n=40). All LA-MRSA isolates (except three LA-MRSA CC9 isolates) were considered as multi-resistant due to their resistance to three or more classes of antimicrobial agents. These results showed that the current dissemination of LA-MRSA also included chickens and turkeys. The LA-MRSA isolates from the same farm or flock at slaughter exhibited a high homogeneity indicating transmission between poultry at farm or flock level. In contrast, the heterogeneity of the LA-MRSA isolates from the abattoir workers might reflect their occupational contact with animals from numerous poultry flocks. In addition, a rare observation was made in a LA-MRSA CC398-t3015 from a broiler farm (CHAPTER 5). This isolate exhibited two different erm(C)-carrying plasmids, pSWS371 and pSWS372. The larger plasmid harbored two more genes, a cop-6 gene and a novel pre/mob gene. Besides the additional genes, both plasmids differed in their rep genes, which assigned them to different incompatibility groups and explains why they can stably coexist in the same bacterial cell. In the second part of this Ph.D. project, the available tools to track the spread of MRSA were considered and the current knowledge about these organisms from food producing animals and food with respect to the role of MRSA to act as a food-borne pathogen were summarized (CHAPTER 7). Based on the published literature it was concluded that only the presence of MRSA in/on food intended for human consumption does not equate to MRSA being classified as a food-borne pathogen. The consumer-related aspects, e.g. age or health status, and also the adherence to kitchen hygiene play an equally important role. In the second review (CHAPTER 8), the latest information on resistance genes so far detected in staphylococci from healthy as well as diseased livestock, wild animals and pets were described. It became obvious that more than 40 different resistance genes have been identified in staphylococci from animals, which confer resistance to virtually all classes of antimicrobial agents approved for use in animals. These resistance genes can be located on mobile genetic elements, which play a major role as carriers of antimicrobial resistance genes and facilitate the exchange of resistance genes with staphylococci of human origin but also with other Gram-positive bacteria. In the third part of the Ph.D. project, the novel lincosamide/ pleuromutilin/streptogramin A resistance gene lsa(E) was identified in an enterococcal multi-resistance gene cluster in MRSA ST398 and MSSA ST9 isolates of human origin from Spain (CHAPTER 9). The lsa(E) gene was the first lsa gene in staphylococci which confers this resistance phenotype and confirms that there is a gene flux between E. faecalis and S. aureus. The lsa(E) gene was also identified in 16 porcine MRSA ST9-t899-IVa isolates from China (CHAPTER 10). In one of these isolates, lsa(E) was located in a slightly different multi-resistance gene cluster on a plasmid. Consequently, the entire plasmid was sequenced to gain insight into the structure and organization of this plasmid. The multi-resistance plasmid pV7037 proved to be 40,971 bp in size and carried, besides the previously determined multi-resistance gene cluster, a functionally active tet(L) gene, a complete cadDX operon and also a functionally deleted variant of the β-lactamase transposon Tn552 (CHAPTER 12). In addition, a comprehensively analysis of the two different types of multi-resistance gene clusters identified the novel spectinomycin resistance gene spw (CHAPTER 11). In a further study, the novel resistance genes lsa(E) and spw were also detected in eleven MRSA CC9 isolates from chicken (n=8) and pig carcasses (n=2) and from a butcher (n=1) from six different wet markets and a supermarket in Hong Kong, as well as in a single MRSA CC398 isolate of a nasally colonized human patient from a German hospital (CHAPTER 13). Ten overlapping PCR assays, which covered the entire cluster, and multi-resistance gene cluster-carrying contigs, which were obtained by whole genome sequencing, showed that all 12 MRSA isolates carried a large part of the pV7037-associated multi-resistance gene cluster. This part included the resistance genes aadE, spw, lsa(E) and lnu(B). These and previous observations suggest that a enterococcal multi-resistance gene cluster with two novel resistance genes has been acquired by MRSA/MSSA CC9 and CC398 of various origins several times at different occasions in Europe and Asia. Moreover, the novel spectinomycin resistance gene spd, recently identified on plasmid pDJ91S, was found in 30 LA-MRSA CC398 isolates from broilers and humans on farms (n=21) or at the slaughterhouses (n=4) in The Netherlands, from turkey meat/-products (n=4) in Germany and Austria, from a diseased pig (n=1) in Germany and also in a single LA-MSSA ST433 isolate from a diseased pig in Germany (CHAPTER 14). Electrotransformation and sequencing identified the spd gene on a novel plasmid, pSWS2889, which is 30 bp smaller and carried a different rep gene in comparison to plasmid pDJ91S. Restriction analysis showed that 22 isolates carried plasmid pSWS2889, whereas plasmid pDJ91S was present in the remaining nine isolates. Furthermore, the analysis of the genetic basis of elevated enrofloxacin MIC´s of ≥ 1 mg/L among 21 MRSA and 15 MSSA isolates of CC 398, CC9, CC5 or sequence type 2269 from pigs, cattle, poultry or food of poultry origin revealed different mutations in the quinolone resistance determining regions of the genes gyrA, gyrB, grlA and grlB as well as in the promoter region of norA (CHAPTER 15). In addition to the previously reported GrlA substitutions, all CC398 isolates, regardless of their origin and their methicillin resistance status, exhibited a Glu422Asp substitution in GrlB and a specific set of norA regulator mutations. The detection of four novel mutations (Ser80Leu and Glu84Asp in GrlA, Glu88Asp and Ser84Ala in GyrA) additionally illustrates the variety and the potential for mutational resistance to emerge.

Seit einigen Jahren ist Staphylococcus aureus, insbesondere Nutztier-assoziierter Methicillin-resistenter S. aureus (LA-MRSA), das Thema vieler wissenschaftlicher Studien. Zu Beginn dieses Ph.D.-Projektes waren jedoch nur sehr wenige Daten über LA-MRSA aus Geflügelbeständen verfügbar. Die Ziele der vorliegenden Studie waren (i) eine umfassende Charakterisierung von Nutztier-assoziierten S. aureus Isolaten von Geflügel durchzuführen, (ii) die Frage, ob es ich bei MRSA um einen lebensmittelbedingten Krankheitserreger handelt, zu beantworten, (iii) einen Überblick über antimikrobielle Resistenzgene bei Staphylokokken zu erarbeiten, sowie (iv) neue antimikrobielle Resistenzgene bei LA-MRSA zu identifizieren. Im ersten Teil des Projektes wurden drei unterschiedliche Testpopulationen untersucht. Die erste Testpopulation umfasste 131 Isolate von klinisch kranken Puten und Hühnern (CHAPTER 3). Innerhalb der Putenisolate (n=80) überwog der klonale Komplex (CC) 398 und 21,2 % der Isolate erwiesen sich als LA-MRSA. Die Mehrheit der Hühnerisolate (n=51) gehörte zum CC5. Nur 9,8 % der Hühnerisolate wurden als LA-MRSA identifiziert, diese gehörten jedoch alle dem CC398 an. In den beiden weiteren Testpopulationen wurden 37 LA-MRSA CC398 Isolate von vier verschiedenen Broiler-Mastbetriebe (Broiler n=11, Broilerstall n=15, Wohnhaus n=5, Menschen, die auf dem Betrieb wohnen/arbeiten n=6) (CHAPTER 4) und 46 LA-MRSA CC398 bzw. CC9 Isolate von Broilern auf vier verschiedenen Schlachthöfen (n=28) und den jeweiligen Schlachthofmitarbeitern (n=18) (CHAPTER 6) untersucht, um eine mögliche Übertragung zwischen den verschiedenen Reservoiren aufzeigen zu können. Die molekulare Analyse aller LA-MRSA Isolate der drei Testpopulationen wies zwei SCCmec- (IV und V), sieben spa- (überwiegend t011) und zwölf dru-Typen (überwiegend dt11a oder dt10q) nach. Die Empfindlichkeitstestung, die DNA-Mikroarray Analysen bzw. gen-spezifische PCR-Assays ergaben eine hohe Variabilität hinsichtlich der Resistenzphäno- (n=41) und -genotypen (n=40). Alle LA-MRSA Isolate (mit Ausnahme von drei LA-MRSA CC9 Isolaten) wurden, anhand ihrer Resistenz gegenüber drei oder mehr Klassen von antimikrobiellen Wirkstoffen, als multiresistent beurteilt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die aktuelle Verbreitung von LA-MRSA auch Hühner und Puten betrifft. Dabei wiesen die LA-MRSA Isolate vom gleichen Mastbetrieb oder der gleichen Herde auf dem Schlachthof eine hohe Ähnlichkeit auf, die auf eine Übertragung zwischen den Tieren des gleichen Mastbetriebs bzw. der gleichen Herde im Schlachthof hindeutet. Im Gegensatz dazu spiegelt die Heterogenität der LA-MRSA Isolate von den Schlachthofmitarbeitern den berufsbedingten Kontakt zu Tieren aus unterschiedlichen Beständen wieder. Im Rahmen dieser Studien wurde außerdem eine seltene Beobachtung in einem LA-MRSA CC398-t3015 Isolat von einem Broiler-Mastbetrieb gemacht (CHAPTER 5). Dieses Isolat wies zwei verschiedene erm(C)-tragende Plasmide, bezeichnet als pSWS371 bzw. pSWS372, auf. Auf dem größeren Plasmid waren zusätzlich zwei weitere Gene, ein cop-6 Gen und eine neues pre/mob Gen, lokalisiert. Neben diesen zusätzlichen Genen unterscheiden sich beide Plasmide in ihren rep Genen, was sie zu unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen zuordnet und erklärt, warum sie nebeneinander in der gleichen Bakterienzelle koexistieren können. Im zweiten Teil dieses Ph.D. Projektes wurden zunächst die verfügbaren Methoden zur Verfolgung einer Ausbreitung von MRSA näher betrachtet. Im Weiteren wurden die aktuellen Erkenntnisse über MRSA von Lebensmittel-liefernden Tieren und Lebensmitteln, in Bezug auf die Rolle von MRSA als lebensmittelbedingtem Krankheitserreger, zusammengefasst (CHAPTER 7). Basierend auf der veröffentlichten Literatur konnte der Schluss gezogen werden, dass nur durch das Vorhandensein von MRSA in/auf für den menschlichen Verzehr bestimmten Lebensmitteln, MRSA nicht als ein lebensmittelbedingter Krankheitserreger angesehen werden sollte. Die verbraucherbezogenen Aspekte, wie Alter oder Gesundheitszustand, und auch die Einhaltung von Grundregeln der Küchenhygiene spielen eine ebenso wichtige Rolle. Im zweiten Review (CHAPTER 8) wurden die neuesten Informationen über bisher detektierte Resistenzgene bei Staphylokokken von gesunden als auch erkrankten Nutztieren, Wildtieren und Haustieren zusammengefasst. Es wurde deutlich, dass bereits mehr als 40 verschiedene Resistenzgene in Staphylokokken von Tieren detektiert wurden, die Resistenz gegenüber fast allen Klassen der für die Anwendung bei Tieren zugelassenen antimikrobiellen Wirkstoffen vermitteln. Diese Resistenzgene können auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert sein, welche eine wichtige Rolle als Träger von antimikrobiellen Resistenzgenen spielen und den Austausch von Resistenzgenen mit Staphylokokken von Menschen aber auch mit anderen Gram-positiven Bakterien erleichtern. Im dritten Teil des Projektes wurde das neue Resistenzgen lsa(E), das Resistenz gegenüber Linkosamiden, Pleuromutilinen und Streptogramin A Antibiotika vermittelt, in einem von Enterokokken stammenden Multiresistenz-Gencluster in MRSA ST398 und MSSA ST9 Isolaten von Menschen aus Spanien identifiziert (CHAPTER 9). Das lsa(E) Gen ist das erste lsa Gen bei Staphylokokken, welches diesen Resistenzphänotyp vermittelt. Sein Nachweis bestätigt einen Genfluss zwischen E. faecalis und S. aureus. Kurze Zeit später wurde das lsa(E) Gen auch bei 16 MRSA ST9-t899-IVa Isolaten von Schweinen aus China identifiziert (CHAPTER 10). In einem dieser Isolate lag das neue Gen plasmid-lokalisiert in einem geringfügig abweichenden Multiresistenz-Gencluster vor. Folglich wurde das gesamte Plasmid sequenziert, um einen Einblick in dessen Struktur und Organisation zu erlangen. Das Multiresistenz-Plasmid pV7037 wies eine Größe von 40.971 bp auf und trug, neben dem bereits detektierten Multiresistenz-Gencluster, ein funktionell aktives tet(L) Gen, ein vollständiges cadDX Operon und eine funktionell deletierte Variante des β-Laktamase-Transposons Tn552 (CHAPTER 12). Darüber hinaus führte die umfassende Analyse der beiden verschiedenen Multiresistenz-Gencluster-Typen zur Identifizierung des neuen Spectinomycin Resistenzgens spw (CHAPTER 11). In einer weiteren Studie wurden die neuen Resistenzgene lsa(E) und spw sowohl in elf MRSA CC9 Isolaten von Hühner- (n=8) und Schweineschlachtkörpern (n=2) sowie von einem Metzger (n=1) auf sechs verschiedenen Frischmärkten und in einem Supermarkt in Hong Kong detektiert, sowie in einem einzelnen MRSA CC398 Isolat eines nasal kolonisierten Patienten in einem deutschen Krankenhaus (CHAPTER 13). Zehn überlappende PCR-Assays, welche das gesamte Cluster abdeckten, sowie durch Gesamtgenomsequenzierung erhaltene das Multiresistenz-Gencluster tragende Contigs bestätigten, dass alle zwölf MRSA Isolate einen Großteil des pV7037-assoziierten Multiresistenz-Genclusters tragen. Dieser Teil beinhaltete die Resistenzgene aadE, spw, lsa(E) und lnu(B). Diese und vorherige Beobachtungen legen nahe, dass ein von Enterokokken stammendes Multiresistenz-Gencluster, welches zwei neue Resistenzgene trägt, von MRSA/MSSA CC9 und CC398 Isolaten unterschiedlicher Herkünfte mehrmals bei verschiedenen Gelegenheiten in Europa und Asien erworben wurde. Des Weiteren wurde das neue Spectinomycin-Resistenzgen spd, welches kürzlich auf dem Plasmid pDJ91S identifiziert wurde, in 30 LA-MRSA CC398 Isolaten von Broilern und Menschen auf Bauernhöfen (n=21) bzw. auf Schlachthöfen (n=4) in den Niederlanden, von Geflügelfleisch/-produkten (n=4) in Deutschland und Österreich, von einem erkrankten Schwein (n=1) in Deutschland und auch in einem einzelnen LA-MSSA ST433 Isolat von einem erkrankten Schwein in Deutschland gefunden. Elektrotransformation und Sequenzierung identifizierten das spd Gen auf einem neuen Plasmid, pSWS2889, welches im Vergleich zu Plasmid pDJ91S 30 bp kleiner war und ein anderes rep Gen trug (CHAPTER 14). Restriktionsanalysen ergaben, dass 22 Isolate Plasmid pSWS2889 trugen, während in den restlichen neun Isolaten Plasmid pDJ91S präsent war. Des Weiteren ergab die Analyse der genetischen Grundlagen für erhöhte Enrofloxacin-MHK-Werte von ≥ 1 mg/L bei 21 MRSA und 15 MSSA Isolaten der CC398, CC9, CC5 oder des Sequenztypes 2269 von Schweinen, Rindern, Geflügel und Geflügelfleisch/-produkten verschiedene Mutationen in den entsprechenden Zielgenen gyrA, gyrB, grlA and grlB sowie in der Regulatorregion des Gens norA (CHAPTER 15). Zusätzlich zu den bereits publizierten GrlA Substitutionen, zeigten alle CC398 Isolate eine Glu422Asp Substitution in der abgeleiteten GrlB-Sequenz und eine spezifische Kombination von Mutationen in der norA Regulatorregion, unabhängig von ihrer Herkunft und ihrem Methicillin-Resistenzstatus. Der Nachweis von vier neuen Mutationen (Ser80Leu und Glu84Asp in GrlA, Glu88Asp und Ser84Ala in GyrA) veranschaulicht zusätzlich die Möglichkeiten und das Potenzial von mutations-basierten Resistenzen sich zu entwickeln.


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